Esta solicitud es una continuación de la solicitud de patente de EE.UU. No. 14/187,265, presentada el 22 de febrero de 2014, que reclama el beneficio de la Solicitud Provisional de EE. UU. No. 61/768,047, presentada el 22 de febrero de 2013, cuyas divulgaciones se incorporan aquí por referencia en su totalidad.
DECLARACIÓN DE APOYO GUBERNAMENTALEste invento fue realizado con apoyo gubernamental bajo el contrato AR063963 otorgado por los Institutos Nacionales de Salud. El gobierno tiene ciertos derechos en la invención.
LISTA DE SECUENCIASEsta aplicación incluye una lista de secuencias, tal como se establece en un archivo de texto compatible con ASCII llamado "S12-001U03_ST25.txt", creado el 6 de enero de 2020 y que contiene 2179 bytes, que se incorpora aquí como referencia en su totalidad.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓNLos telómeros comprenden secuencias repetitivas de ADN en los extremos de los cromosomas lineales que, cuando son lo suficientemente largos, permiten que cada extremo cromosómico forme un bucle que protege los extremos para que no actúen como roturas de ADN monocatenario o bicatenario. Artandi & DePinho (2010) Carcinogénesis 31:9-18. Los telómeros se acortan con el tiempo, debido en parte al daño oxidativo y la replicación incompleta del ADN, lo que eventualmente conduce a telómeros críticamente cortos incapaces de formar el bucle protector, exposición de los extremos cromosómicos, fusiones cromosoma-cromosoma, respuestas al daño del ADN y senescencia celular, apoptosis, o malignidad. O'Sullivan y Karlseder (2010) Nat. Rev Mol. Biol celular. 11:171-181; Calado et al. (2012) Leucemia 26:700-707; Artandi y DePinho (2010) Carcinogénesis31:9-18.
El complejo enzimático telomerasa extiende los telómeros y consta de dos componentes esenciales: la transcriptasa inversa de la telomerasa (TERT) y un componente de ARN conocido como componente de ARN de la telomerasa (TERC). Otros componentes del complejo de la telomerasa incluyen las proteínas TCAB1, Dyskerin, Gar1, Nhp2, Nop10 y RHAU. Broulette et al. (2003) Arteriosclerosis, Trombosis y Biología Vascular 23:842-846. TERT es un componente limitante del complejo de telomerasa y, por lo tanto, los tratamientos que aumentan TERT pueden aumentar la actividad de la telomerasa. La actividad de la telomerasa generalmente se mide mediante el ensayo del protocolo de amplificación repetida telomérica (TRAP), que cuantifica la capacidad de un lisado celular u otra muestra para extender una secuencia de ADN similar a un telómero sintético.
Como era de esperar debido a la importancia del mantenimiento de la longitud de los telómeros en la prevención de la senescencia celular y la apoptosis y la disfunción celular resultante, las mutaciones genéticas de TERT y TERC están vinculadas a enfermedades hereditarias mortales de mantenimiento inadecuado de los telómeros, incluidas formas de fibrosis pulmonar idiopática, disqueratosis congénita, y anemia aplásica. Los efectos de la senescencia celular prematura y la apoptosis debido a los telómeros cortos en estas enfermedades son devastadores en sí mismos y pueden verse agravados por un mayor riesgo de cáncer. Artandi y DePinho (2010) Carcinogénesis 31:9-18; Alter et al. (2009) Sangre 113:6549-6557. Además de abundantes datos correlativos que relacionan los telómeros cortos con el cáncer (Wentzensen et al. (2011) Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev.20:1238-1250), la anemia aplásica proporciona algunas de las primeras pruebas directas de que los telómeros críticamente cortos y la inestabilidad cromosómica resultante predisponen a las células a la transformación maligna en humanos (Calado et al. (2012) Leukemia 26:700-707). Existe evidencia de que los telómeros cortos marcan la diferencia entre la distrofia muscular fatal y no fatal (Sacco et al. (2010) Cell 143:1059-1071), y que la extensión de los telómeros evita la senescencia de las células endoteliales (Matsushita et al. (2001) Circ . Res. 89:793-798), que se asocia con aterosclerosis, hipertensión y enfermedades cardíacas (Pérez-Rivero et al. (2006) Circulation114:309-317). Además de estar implicados en estas y otras enfermedades, los telómeros cortos también limitan la amplificación celular para terapias celulares y aplicaciones de bioingeniería. Mohsin et al. (2012) Diario del Colegio Americano de Cardiología doi:10.1016/j.jacc.2012.04.0474.
Un activador de la telomerasa derivado de un producto natural, TA-65®, ha sido vendido comercialmente como nutracéutico por TA Sciences, Inc. Harley et al. (2011) Investigación de rejuvenecimiento 14: 45-56. Este compuesto supuestamente activa el gen hTERT endógeno, activando así la expresión de la telomerasa nativa. No está claro, sin embargo, cómo este tratamiento supera la regulación normal de la actividad de la telomerasa nativa.
Se han transfectado células humanas con poca o ninguna actividad de telomerasa con vectores que codifican TERT humano (hTERT). Véase, por ejemplo, Bodnar et al. (1998) Ciencia 279:349-352. Se encontró que las células transfectadas expresaban telomerasa, mostraban telómeros alargados, se dividían vigorosamente y mostraban una senescencia reducida en comparación con las células que carecían de telomerasa, pero la modificación genómica resultante de este tratamiento aumenta el riesgo y limita la utilidad del enfoque.
Una capacidad limitada para replicarse es una de las características definitorias de la mayoría de las células normales. Un punto final de este proceso replicativo limitado es la senescencia, un estado detenido en el que la célula permanece viable pero ya no se divide. Las células senescentes a menudo se caracterizan por un patrón alterado de expresión génica, una morfología alterada y una capacidad reducida o anulada para realizar sus funciones normales.
El acortamiento de los telómeros juega un papel directo en la senescencia celular en los tejidos animales durante el envejecimiento. Además, se está acumulando evidencia que implica a los telómeros cortos en una variedad de enfermedades, incluidas las descritas anteriormente. La perspectiva de prevenir enfermedades mediante la extensión de los telómeros motiva la necesidad de tratamientos seguros y efectivos para extender los telómeros en células animales in vivo y/o in vitro. Además, existe la necesidad de extender de forma segura y rápida los telómeros en las células para su uso en terapia celular, ingeniería de células y tejidos y medicina regenerativa.
Al mismo tiempo, sin embargo, existe un peligro en la activación constitutiva de la actividad de la telomerasa. De hecho, para las aplicaciones de terapia celular, evitar el riesgo de inmortalización celular es de suma importancia. Con este fin, la actividad de telomerasa transitoria, en lugar de constitutiva, puede ser ventajosa para la seguridad, especialmente si la actividad de telomerasa elevada no solo es breve sino que extiende los telómeros lo suficientemente rápido como para que el tratamiento no necesite repetirse continuamente. Los métodos actuales para extender los telómeros incluyen la administración viral de TERT bajo un promotor inducible, la administración de TERT utilizando vectores basados en adenovirus y virus adenoasociados, y activadores de telomerasa de molécula pequeña. Estos métodos corren el riesgo de mutagénesis por inserción, elevación continua de la actividad de la telomerasa o ambos.
Por lo tanto, existe una fuerte motivación para desarrollar una terapia que amplíe los telómeros de forma segura para prevenir, retrasar, mejorar o tratar estas y otras afecciones y enfermedades, para hacer lo mismo con la disminución gradual de la forma y función física y la función mental que acompaña a la evolución cronológica. envejecimiento, y posibilitar las terapias celulares y la medicina regenerativa. Tal terapia sería de gran utilidad en el rejuvenecimiento de todos los animales, incluidos humanos, mascotas, ganado, animales de zoológico y animales de especies en peligro de extinción.
SUMARIO DE LA INVENCIÓNLa presente invención aborda estos y otros problemas al proporcionar una alternativa que ofrece los beneficios de un aumento altamente transitorio en la actividad de la telomerasa, combinado con una rápida extensión de los telómeros, de modo que el tratamiento no necesita ser continuo o incluso frecuente, y sin riesgo de daño genómico. mutagénesis por inserción. Específicamente, la invención proporciona composiciones, métodos y kits para la extensión de los telómeros mediante la traducción transitoria de la actividad de la telomerasa exógena en una célula.
En un aspecto, la invención proporciona compuestos para la extensión de telómeros que comprenden:
un ácido ribonucleico sintético que comprende al menos un nucleósido modificado y codifica una transcriptasa inversa de telomerasa;
donde los telómeros se extienden dentro de una célula tratada con el compuesto.
En algunas realizaciones, la transcriptasa inversa de telomerasa es una transcriptasa inversa de telomerasa de mamíferos, aves, reptiles o peces o una variante que retiene la actividad catalítica de la telomerasa, y en realizaciones específicas es una transcriptasa inversa de telomerasa humana.
En algunas realizaciones, el ácido ribonucleico comprende un casquete en 5', una región no traducida en 5', una región no traducida en 3' y una cola poli-A. El casquete 5' puede no ser inmunogénico y el casquete 5' puede haber sido tratado con fosfatasa.
En realizaciones preferidas, la cola poli-A aumenta la estabilidad del ácido ribonucleico.
En otras realizaciones preferidas, la región no traducida 5' o la región no traducida 3' comprenden una secuencia de un ARNm estable o un ARNm que se traduce de manera eficiente, o ambos comprenden una secuencia de un ARNm estable o un ARNm que se traduce de manera eficiente.
En aún otras realizaciones preferidas, la caperuza 5', la región no traducida 5' o la región no traducida 3' estabiliza el ácido ribonucleico, aumenta la tasa de traducción del ácido ribonucleico o modula la inmunogenicidad del ácido ribonucleico.
En realizaciones muy preferidas, el al menos un nucleósido modificado modula la inmunogenicidad del ácido ribonucleico.
En algunas realizaciones, el ácido ribonucleico es un ácido ribonucleico sintético purificado.
En realizaciones preferidas, el ácido ribonucleico sintético se purifica para eliminar los componentes inmunogénicos.
En ciertas realizaciones específicas, el ácido ribonucleico codifica una transcriptasa inversa de telomerasa humana, de gato, perro, ratón, caballo, vaca, oveja, cerdo, elefante africano, pollo, rata, pez cebra, medaka japonés o chimpancé, o un polipéptido con al menos al menos 95% de identidad de secuencia con la transcriptasa inversa de la telomerasa.
En otro aspecto, la invención proporciona composiciones que comprenden un compuesto de la invención y un componente de ARN de telomerasa que, en algunas realizaciones, es un componente de ARN de telomerasa de mamífero, ave, reptil o pez. En realizaciones más específicas, el componente de ARN de telomerasa es un componente de ARN de telomerasa humana. En algunas realizaciones, los compuestos y las composiciones de la invención comprenden además un vehículo de administración.
En algunas realizaciones, el vehículo de administración es un exosoma, una nanopartícula lipídica, una nanopartícula polimérica, una partícula de lipoproteína natural o artificial, un lípido catiónico, una proteína, un complejo de proteína-ácido nucleico, un liposoma, un virosoma o un polímero. En realizaciones específicas, el vehículo de administración es un lípido catiónico.
En realizaciones preferidas, el vehículo de administración no es inmunogénico. En otras realizaciones preferidas, el vehículo de administración es parcialmente inmunogénico. En particular, bajo algunas circunstancias, puede ser deseable que el vehículo conserve alguna inmunogenicidad.
De acuerdo con otro aspecto de la invención, se proporcionan métodos para extender los telómeros, que comprenden el paso de administrar cualquiera de los compuestos o composiciones divulgados a una célula animal, donde al menos un telómero se extiende dentro de la célula.
En algunas realizaciones del método, la célula tiene al menos un telómero acortado antes del paso de administración.
En algunas realizaciones, la célula es de o en un sujeto que sufre o está en riesgo de padecer una enfermedad relacionada con la edad, una afección relacionada con la edad o una disminución relacionada con la edad en la función o apariencia.
En algunas realizaciones, la célula es de o en un sujeto que padece o está en riesgo de cáncer, enfermedad cardíaca, accidente cerebrovascular, diabetes, úlceras diabéticas, enfermedad de Alzheimer, osteoporosis, disminución de la capacidad física o apariencia, trauma físico o estrés físico crónico, trauma psicológico o estrés psicológico crónico, función inmunológica reducida, inmunosenescencia o degeneración macular.
En algunas realizaciones, la célula es una célula somática de linaje endodérmico, mesodérmico o ectodérmico, o una línea germinal o una célula embrionaria.
En algunas realizaciones, la célula es una célula madre pluripotente inducida o una célula utilizada para producir una célula madre pluripotente inducida.
En algunas realizaciones, la célula es una célula transdiferenciada o una célula utilizada para producir una célula transdiferenciada.
En algunas realizaciones, la célula es una célula aislada y el paso de administración no dura más de 48 horas. En otras realizaciones, la célula es una célula aislada y el paso de administración dura al menos 2 horas.
En algunas realizaciones, la célula es una célula aislada y el paso de administración se realiza no más de cuatro veces. En otras realizaciones, la célula es una célula aislada y el paso de administración se realiza al menos dos veces.
En algunas realizaciones, la célula es una célula aislada y el método comprende además el paso de medir la actividad de la telomerasa en la célula. En realizaciones específicas, el paso de administración aumenta la actividad de la telomerasa en la célula, y en realizaciones aún más específicas, la actividad de la telomerasa aumenta transitoriamente en al menos un 5%. En otras realizaciones específicas, la vida media de la actividad de telomerasa aumentada no es superior a 48 horas.
En algunas realizaciones, el método comprende además el paso de medir la longitud de los telómeros en la célula. En realizaciones específicas, la longitud media de los telómeros aumenta en al menos 0,1 kb.
En algunas realizaciones, la célula es una célula aislada y el método comprende además el paso de medir la capacidad de duplicación de la población en la célula. En realizaciones específicas, la capacidad de duplicación de la población aumenta, en algunos casos en al menos una duplicación de la población.
En realizaciones preferidas, la célula es de o en un sujeto mamífero, y en realizaciones aún más preferidas, la célula es de o en un sujeto humano.
En algunas realizaciones, la célula es una célula aislada y, en otras realizaciones, la célula no es una célula aislada. En algunas realizaciones, el paso de administración comprende la electroporación. En algunas realizaciones, el al menos un telómero se extiende transitoriamente dentro de la célula.
De acuerdo con otro aspecto más de la invención, se proporcionan kits para extender los telómeros en una célula animal, comprendiendo los kits cualquiera de los compuestos o composiciones anteriores e instrucciones para usar el compuesto o la composición para extender los telómeros.
En algunas realizaciones, los kits comprenden además materiales de embalaje. En algunas realizaciones específicas, los materiales de envasado son herméticos. En algunas realizaciones específicas, los materiales de envasado comprenden un recipiente de lámina metálica.
En algunas realizaciones, los kits comprenden además un desecante, un medio de cultivo o un inhibidor de ARNasa.
En algunas realizaciones, la composición es estéril. En algunas realizaciones, el kit comprende un compuesto de la invención, instrucciones para usar la composición para extender los telómeros y un componente de ARN de telomerasa, un vehículo de administración o tanto un componente de ARN de telomerasa como un vehículo de administración.
En otro aspecto más, la invención proporciona métodos de tratamiento, que comprenden administrar un compuesto o composición de la invención a un sujeto animal que necesita, o que puede beneficiarse de, la extensión de los telómeros. En algunas realizaciones, el sujeto animal sufre o corre el riesgo de padecer una enfermedad o afección como resultado de telómeros acortados.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOSFIGURAS. 1A-1D. La transfección de células MRC-5 con un ácido ribonucleico modificado (modRNA) que codifica TERT, pero no TERT catalíticamente inactivo (CI TERT), aumenta transitoriamente la actividad de la telomerasa.HIGO. 1A: Esquema de la construcción modRNA y el enfoque utilizado en estos estudios. La construcción modRNA codifica TERT humana y tiene UTR 5 'y 3' que confieren estabilidad, como el ARNm de β-globina. CI TERT tiene una sola mutación pb.HIGO. 1B: La transfección de TERT o CI TERT modRNA da como resultado un aumento de los niveles de TERT modRNA exógeno en las células tratadas, pero no en los controles no tratados, por encima de los niveles endógenos de TERT RNA.HIGO. 1C: Los niveles de proteína reconocidos por el anticuerpo anti-TERT son significativamente más altos en las células MRC-5 24 horas después de la transfección con modRNA que codifica TERT o CI TERT (P<0,03 o 0,01, respectivamente) que en las células no tratadas o solo con vehículo.HIGO. 1D: El tratamiento con modRNA que codifica TERT, pero no CI TERT, provoca un aumento transitorio de la actividad de la telomerasa en las células MRC-5.
HIGO. 2. Uso de exosomas como vehículo de administración para tratamientos con ácido ribonucleico.
HIGO. 3. Ilustración gráfica del uso de múltiples tratamientos rápidos y transitorios con telomerasa en la extensión de los telómeros en una célula.
FIGURAS. 4A-4G. El tratamiento con modRNA TERT extiende rápidamente los telómeros en las células MRC-5.HIGO. 4A: Programa de tratamiento y ensayo utilizado en estos estudios. Los tratamientos duraron 5 horas.HIGO. 4B: Imagen de TRF Southern blot (recuadro) y su cuantificación en la que la señal quimioluminiscente se normalizó para tener en cuenta el número de sondas por unidad de longitud de telómero, y luego se trazó la intensidad promedio de cada fila de píxeles en cada carril de gel en relación con el telómero. longitud (n=3 repeticiones biológicas para cada tratamiento).HIGO. 4C: Promedios de las distribuciones de longitud de los telómeros enHIGO. 4B, lo que revela que los telómeros en las células tratadas con modRNA de TERT son significativamente (P<0.014) más largos que en los controles no tratados o tratados solo con vehículo.HIGO. 4D: La proporción de telómeros más largos que un umbral arbitrario (4,2 kb) es mayor en las células tratadas con modRNA de TERT que en los controles no tratados y tratados solo con vehículo.HIGO. 4E: Micrografía de fluorescencia representativa de la propagación en metafase de los fibroblastos MRC-5 utilizados en la hibridación in situ cuantitativa (Q-FISH) para comparar las longitudes de los telómeros, que muestra la sonda del telómero (clara, punteada) y el ADN (sombreado suave).HIGO. 4F: Cuantificación de las mediciones de Q-FISH de la longitud de los telómeros en las células tratadas y de control (n = 15 células para cada una de las dos réplicas biológicas para cada tratamiento), que muestra una rápida extensión de los telómeros en las células tratadas. (Tenga en cuenta que TRF mide la longitud del ADN telomérico y subtelomérico, mientras que Q-FISH mide solo el ADN telomérico, lo que explica las diferencias entre los resultados de Q-FISH y TRF).HIGO. 4G: (i) Curva estándar que relaciona las duplicaciones de la población acumulada de células MRC-5 después de recibirlas del proveedor con la longitud de los telómeros medida con Q-FISH para cuantificar la fluorescencia total promedio de la sonda de los telómeros por célula, que es linealmente proporcional a la longitud de los telómeros. (ii) Cuantificación de la longitud media de los telómeros por célula en células MRC-5 tratadas tres veces con modRNA de TERT a intervalos de 48 horas, medida con Q-FISH.
FIGURAS. 5A-5C. El tratamiento breve con modRNA de TERT aumenta la capacidad replicativa de las células MRC-5, pero no las inmortaliza, de manera dependiente de la dosis.HIGO. 5A: Curvas de crecimiento de células tratadas con TERT modRNA una, dos o tres veces, o tres veces seguidas de un tratamiento adicional 8 semanas después del primer tratamiento. Los controles comprenden ningún tratamiento o tratamiento con vehículo solamente o CI TERT cuatro veces. (n=3 para cada tratamiento).HIGO. 5B: Curvas de crecimiento de células tratadas con TERT modRNA y TERC RNA en una relación molar 1:5 (n=3).HIGO. 5C: El tratamiento una, dos o tres veces con modRNA de TERT confiere capacidad de replicación adicional a las células MRC-5 más allá de las células no tratadas, de manera dependiente de la dosis. El incremento incremental en la capacidad proliferativa conferida por el segundo y tercer tratamientos, administrado 48 horas después del primer tratamiento, no es tan grande como el incremento en la capacidad proliferativa conferida por el primer tratamiento; sin embargo, un cuarto tratamiento adicional varias semanas después de los primeros tres tratamientos confiere tanta capacidad proliferativa adicional como el primer tratamiento, lo que indica que el momento de los tratamientos es importante para optimizar la cantidad de capacidad proliferativa conferida por el tratamiento. Tratamiento tres veces con TERT modRNA y TERC modRNA juntos en 1: La relación molar 5 confiere una mayor capacidad proliferativa que el tratamiento tres veces con modRNA TERT solo. El tratamiento solo con vehículo o CI TERT modRNA no confiere capacidad replicativa adicional. (n=3).
FIGURAS. 6A-6C. Alta eficiencia de transfección de células MRC-5 tratadas con modRNA que codifica GFP nuclear (nGFP).HIGO. 6A: Porcentaje de células con fluorescencia más de dos DE por encima de la media de las células no tratadas (n=10000).HIGO. 6B: Media de fluorescencia (n=10000).HIGO. 6C: Micrografía de fluorescencia de nGFP en células MRC-5 transfectadas, contrateñidas con DAPI.
HIGO. 7. Dosis-respuesta de la actividad de la telomerasa.
FIGURAS. 8A-8B. El tratamiento con TERT modRNA retrasa la inflamación celular en las células MRC-5.HIGO. 8A: Las células MRC-5 en los pases iniciales (izquierda) tienen un área varias veces menor que las células en los pases posteriores (derecha), como se muestra en micrografías típicas de células PD 2 y PD 53 no tratadas en un hemocitómetro.HIGO. 8B: Las células MRC-5 de paso temprano (PD 2) y medio (PD 35) exhiben poca hinchazón, definida como un diámetro superior a 25 micras medido visualmente en un hemocitómetro (donde un cuadrado pequeño tiene 50 micras de ancho), mientras que una mayor fracción de células de paso tardío (PD 53) están hinchadas. Por el contrario, las células PD 53 que habían sido tratadas con modRNA de TERT, pero no las tratadas con modRNA de TERT CI, en PD 40 presentan poca hinchazón.
HIGO. 9. Curva de crecimiento para células endoteliales dérmicas microvasculares humanas (HMDEC).
HIGO. 10. Efecto del tratamiento con modRNA TERT en el número de células en HMDEC. CO: tratamiento control; hTERT-CI: hTERT catalíticamente inactivo; hTERT-WT: hTERT de tipo salvaje.
HIGO. 11. Efecto del tratamiento con modRNA TERT en el crecimiento de HMDEC. UT: sin tratar; CO: tratamiento control; CI: hTERT catalíticamente inactiva; WT: hTERT de tipo salvaje.
HIGO. 12. Efecto del tratamiento con modRNA TERT sobre la senescencia en HMDEC. NT: sin tratar; hTERT-CI: hTERT catalíticamente inactivo; hTERT-WT: hTERT de tipo salvaje.
FIGURAS. 13A-13D. Aumentos en la actividad de la proteína TERT y la telomerasa luego de la administración de ARNm TERT modificado.HIGO. 13A: Esquema de ARNm modificado que comprende la secuencia codificante de la forma funcional completa de TERT o una forma catalíticamente inactiva (CI) de TERT, flanqueada por regiones no traducidas (UTR) de HBB y una cola poli-A de 151 nt, sintetizada utilizando modificado nucleótidos pseudouridina y 5-metilcitidina.HIGO. 13B: La eficiencia de transfección de mioblastos (n=2000) tratados con 0,8 μg/ml de ARNm modificado que codifica GFP medido por citometría de flujo 24 h después de la transfección superó el 95 % (parcelas adicionales enHIGO. 16A).HIGO. 13C: Los niveles totales de proteína TERT se midieron mediante transferencia de Western cuantitativa (panel C, izquierda;HIGO. 17). Cuantificación de los niveles de proteína TERT 24 horas después de la transfección con 1 μg/ml de ARNm de TERT o CI TERT (n=3). La cuantificación de la proteína TERT en respuesta a varias dosis de ARNm se midió a nivel de células individuales mediante citometría de flujo (n = 10 000) (panel C, derecha). *P<0,05, **P<0,01 en comparación con las células no tratadas. Las barras de error representan semHIGO. 13D: Detección de la actividad de la telomerasa en fibroblastos y mioblastos transfectados con 1 μg/ml de ARNm de TERT modificado, medida mediante el protocolo de amplificación repetida de telómeros (TRAP). La flecha indica los controles internos para la eficacia de la PCR.
FIGURAS. 14A-14E. Aumentos en la longitud de los telómeros y la capacidad proliferativa después de la administración de ARNm de TERT modificado (ARNmod).HIGO. 14A: Las longitudes medias de los telómeros en los fibroblastos no tratados disminuyeron con el tiempo en cultivo según lo medido por MMqPCR y por SpectraCell (coeficiente de correlación 0,97, P<0,001). El experimento se repitió dos veces con cuatro réplicas técnicas cada una.HIGO. 14B: Longitudes medias de los telómeros en fibroblastos transfectados con 1 μg/ml de ARN mod de TERT, ARNm de CI TERT o vehículo solo, una, dos o tres veces seguidas a intervalos de 48 h. El experimento se repitió dos veces con cuatro réplicas técnicas cada una. **P<0,01, ***P<0,001 en comparación con las células tratadas solo con vehículo.HIGO. 14C: Longitudes medias de los telómeros en mioblastos tratados como enHIGO. 14B. El experimento se repitió dos veces con cuatro réplicas técnicas cada una. ***P<0,001 en comparación con las células tratadas solo con vehículo.HIGO. 14D: Curvas de crecimiento de fibroblastos tratados como enHIGO. 14B, con flechas verticales que indican tiempos de tratamientos. Las curvas de crecimiento se repitieron dos veces con cada población cultivada por triplicado. La capacidad replicativa aumentó de manera dependiente de la dosis (panel derecho). *P<0,05, **P<0,01 en comparación con las células tratadas solo con vehículo.HIGO. 14E: Capacidad de proliferación de los mioblastos, tratados como enHIGO. 14B(flechas verticales). Las curvas de crecimiento se repitieron dos veces, con cada población cultivada por triplicado. Todos los datos se presentan como medios ± sem
FIGURAS. 15A-15C. Reducción transitoria de marcadores asociados a la senescencia después de la entrega de ARNm TERT modificado.HIGO. 15AFigura: Cuantificación de fibroblastos que expresan β-gal después de la transfección de ARNm de TERT modificado tres veces seguidas a intervalos de 48 h (flechas verticales). Las células de control, que comprenden poblaciones no tratadas, con vehículo solo y tratadas con ARNm de CI TERT, dejaron de expandirse en PD 53, y la población tratada con modRNA de TERT dejó de expandirse en PD 80. Cada experimento se realizó dos veces con >50 células por muestra puntuadas manualmente . Las imágenes representativas muestran fibroblastos tratados con modRNA TERT teñidos con β-gal en PD 53 (arriba) y PD 80 (abajo). La longitud de la barra de escala es de 200 micrones.HIGO. 15B: Cuantificación de la expresión de β-gal en mioblastos tratados como enHIGO. 15A. Los controles son como enHIGO. 15A. Las poblaciones de control y tratadas con modRNA TERT dejaron de expandirse en PD 8 y PD 11, respectivamente. Cada experimento se realizó dos veces, con >50 células por muestra puntuadas manualmente. Las imágenes representativas muestran mioblastos en PD 2 (arriba) y mioblastos tratados con modRNA TERT en PD 11 (abajo).HIGO. 15CCuantificación de células agrandadas asociadas con senescencia replicativa en fibroblastos transfectados tres veces con ARNm de TERT modificado. Las mesetas de población son como enHIGO. 15A. Los controles son solo vehículo y están tratados con ARNm de CI TERT. Cada experimento se realizó dos veces, con >50 células por muestra puntuadas manualmente. Las imágenes representativas muestran fibroblastos no tratados en PD 2 (arriba) y PD 53 (abajo). Todos los datos se presentan como medias ± sem. La longitud de la barra de escala es de 200 micras.
FIGURAS. 16A-16E. Transfección de alta eficiencia de ARNm modificado en mioblastos humanos.FIGURAS. 16A y 16B: Cuantificación de mioblastos fluorescentes GFP (n=2000) transfectados con 0,1-0,8 μg/ml de ARNm modificado que codifica GFP medido por citometría de flujo 24 h después del inicio del tratamiento.HIGO. 16C: Fluorescencia media de mioblastos transfectados con ARNm de GFP modificado en respuesta a dosis crecientes.HIGO. 16D: Cuantificación de modRNA TERT exógeno en fibroblastos 24 h después de la transfección con 1 μg/ml de TERT o CI TERT modRNA, medido mediante RT-qPCR. La proporción de TERT a CI TERT se calculó utilizando el método de Pfaffl con RPL37A y GAPDH como genes de referencia (n = 3).HIGO. 16E: Cuantificación de modRNA TERT endógeno en fibroblastos 24 h después de la transfección con 1 μg/ml de TERT o CI TERT modRNA, medido mediante qPCR, calculado como enHIGO. 16D. Todos los datos se presentan como medios ± sem
HIGO. 17. Expresión de TERT después de la entrega de ARNm modificado. La expresión de la proteína TERT en fibroblastos recolectados 24 h después del inicio del tratamiento con 1 μg/ml de ARNmod de TERT se midió mediante transferencia Western infrarroja multiplexada. La dilución en serie de la proteína total se usó para generar una curva estándar para comparar las cantidades relativas de proteína TERT con los controles. La especificidad del anticuerpo TERT utilizado aquí ha sido ampliamente probada (Wu, 2006).
HIGO. 18. Gel TRAP que muestra un aumento de la actividad de la telomerasa en células mononucleares electroporadas con modRNA de TERT en un ajuste de 200 V, 25 uF, 1000 Ohm, en una cubeta de 1 mm con 10 ul de suspensión celular y modRNA de TERT. El carril de muestra tratado con calor contiene un artefacto de dímero de cebador del método, como lo indica la banda fuerte en el cuarto peldaño de la escalera.
HIGO. 19. Imágenes de microscopio de células mononucleares que emiten fluorescencia después de la electroporación con modRNA que codifica GFP.
HIGO. 20. La electroporación de modRNA GFP en leucocitos humanos (células mononucleares) da como resultado una alta eficiencia de transfección.
HIGO. 21. Imagen del gel del ensayo TRAP que muestra el aumento de la actividad de la telomerasa en fibroblastos sometidos a electroporación con dosis crecientes de modRNA TERT.
HIGO. 22. Micrografías fluorescentes que muestran que las células T CD8+ activadas con CD3/CD28 y electroporadas con modRNA GFP expresan actividad GFP. Los puntos oscuros son perlas recubiertas de CD3/CD28.
HIGO. 23. La electroporación de queratinocitos humanos con modRNA de TERT da como resultado la expresión de la actividad de la telomerasa.
HIGO. 24. Expresión de un modRNA de luciferasa después de la entrega in vivo a un roedor.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE EL INVENTOLos telómeros son secuencias de ADN en los extremos de los cromosomas que protegen los extremos de los cromosomas pero que se acortan con el tiempo. Los telómeros críticamente cortos pueden hacer que las células dejen de funcionar correctamente o mueran. Los telómeros críticamente cortos también pueden conducir a fusiones cromosómicas que a su vez pueden provocar cáncer. Incluso en ausencia de una enfermedad específica diagnosticada, los telómeros cortos están implicados en la disminución gradual de la función de la mente y el cuerpo y en la apariencia del envejecimiento.
Al mismo tiempo, sin embargo, el acortamiento de los telómeros puede desempeñar un papel protector contra el cáncer, por ejemplo, en la situación en la que una célula adquiere una mutación que hace que se perfile más rápido que las células normales. En esa situación, el acortamiento de los telómeros evita que la célula prolifere indefinidamente y provoque cáncer. Por lo tanto, no es necesariamente beneficioso extender los telómeros continuamente.
En los mamíferos, los telómeros comprenden repeticiones en tándem de la secuencia TTAGGG, y en otros animales como aves, reptiles y peces, la secuencia repetida varía. En todos estos tipos de animales, los telómeros son de doble cadena para muchas kilobases (kb). Las longitudes promedio de los telómeros difieren entre las especies, como se muestra en la Tabla 1.
| TABLA 1 |
|
| Longitud media de los telómeros en fibroblastos adultos de diferentes especies |
| Especies | Longitud media de los telómeros (kb) |
|
| Vaca | 18 |
| Oveja | 18 |
| Cerdo | 15 |
| Caballo | 14 |
| Perro | 15 |
| Panda | 25 |
| Tigre | 50 |
| Ratón doméstico | 40 |
| ratón venado sonorense | 9 |
| rata noruega | 40 |
| Rata topo desnuda | dieciséis |
| conejo blanco europeo | 50 |
| Conejo de cola negra | 25 |
| mono araña | 7 |
| Mono ardilla | 9 |
| Mono rhesus | dieciséis |
| Orangután | 10 |
| Bonobo | 10 |
| Humano | 9 |
| elefante indio | 15 |
| elefante africano | 14 |
| Gato | 11 |
|
En los seres humanos, los telómeros comienzan antes del nacimiento con una longitud de 15 a 20 kb y al nacer con una longitud de 12 a 15 kb. Los telómeros se acortan rápidamente durante la infancia, y luego entre 0 y 100 pb por año en promedio en la edad adulta, una tasa que varía según el tipo de célula, la exposición al estrés psicológico u oxidativo y otros factores.
Los telómeros son parte del complejo de telómeros, que protege los extremos de los cromosomas. El complejo de telómeros también comprende un conjunto de proteínas denominadas colectivamente Shelterin. Las proteínas del complejo telomérico incluyen POT1, TPP1, ATM, DAT, TRF1, TRF2, Rapl, Rifl, TIN2, NBS, MRE17 y RAD50 y sus homólogos en diferentes especies de mamíferos. Podlevsky y Chen (2012) Mutat. Res. 730:3-11. En muchas especies, el telómero termina en un saliente 3' monocatenario que se inserta en la región de doble cadena, en asociación con proteínas del complejo telomérico, formando un bucle dentro del complejo telomérico.
Los telómeros se acortan con el tiempo, debido al daño oxidativo y al intercambio de cromátidas hermanas, y también debido al problema de la replicación final, en el que los extremos de los cromosomas no se duplican por completo durante la mitosis. Cuando los telómeros se acortan críticamente, el complejo de telómeros ya no puede proteger los extremos de los cromosomas y los extremos de los cromosomas se “desprotegen”. La desprotección de los extremos de los cromosomas puede resultar en fusiones cromosoma-cromosoma, lo que a su vez puede resultar en cáncer. O'Sullivan y Karlseder (2010) Nat. Rev Mol. Biol celular. 11:171-181; Calado et al. (2012) Leucemia 26:700-707; Artandi y DePinho (2010) Carcinogénesis31:9-18. El desoperculado también puede dar lugar a que los extremos de los cromosomas se reconozcan como ADN dañado, activando las respuestas al daño del ADN y desencadenando la apoptosis o la senescencia de las células. La senescencia es un estado detenido en el que la célula permanece viable pero ya no se divide, y las células senescentes normalmente dejan de realizar sus funciones útiles normales previas a la senescencia de manera adecuada o en absoluto. Por lo tanto, el acortamiento de los telómeros conduce a la disfunción tisular, la pérdida de la capacidad física y la apariencia juvenil, la pérdida de la capacidad mental y la enfermedad, en parte debido a la acumulación de células senescentes y en parte debido a la pérdida de células por apoptosis. De hecho, las personas mayores con telómeros cortos tienen aproximadamente un 200-750 % más de probabilidades de desarrollar un infarto de miocardio (200 %) (von Zglinicki et al. (2000)investigación de laboratorio; a Journal of Technical Methods and Pathology 80:1739-1747), demencia vascular (200%) (Testa et al. (2011) Diabetic Medicine 28:1388-1394, diabetes con complicaciones (400%) (Blackburn et al. (2010) ) Cancer Prevention Research 3:394-402, cáncer (Stern y Bryan (2008) Cytogenetic and Genome Research 122:243-254), accidente cerebrovascular, enfermedad de Alzheimer, infección (750 %), fibrosis pulmonar idiopática y otras enfermedades. es probable que los telómeros cortos en un tejido también tengan telómeros cortos en la mayoría de sus otros tejidos y, por lo tanto, los telómeros cortos se correlacionan con un mayor riesgo de muchas enfermedades en un individuo.Takubo et al.(2010) Geriatr Gerontol Int.10 Suplemento 1:S197-206; doi: 10.1111/j.1447-0594.2010.00605.x. Los telómeros cortos también limitan la capacidad de replicación celular, lo que a su vez limita las terapias celulares y las terapias regenerativas. Por el contrario, aumentar la longitud de los telómeros en ratones con telómeros cortos utilizando métodos de ingeniería genética basados en virus rejuvenece a los ratones según varios parámetros, incluidos el grosor y la elasticidad de la piel, la función hepática y el sentido del olfato. Jaskelioff (2011) Naturaleza 469: 102-107.
Dado que la telomerasa extiende los telómeros, un enfoque útil para extender los telómeros es aumentar el nivel de actividad de la telomerasa en las células. Se ha informado que muchos agentes y condiciones aumentan la actividad de la telomerasa en las células, incluidos los agentes y condiciones enumerados en la Tabla 2.
| TABLA 2 |
|
| Ejemplos de agentes y condiciones que aumentan la actividad de la telomerasa |
| Escribe | Ejemplos |
|
| Crecimiento | EGF, IGF-1, FGF-2, VEGF (Liu et al. (2010) Envejecimiento |
| factores | Revisiones de investigación 9: 245-256) |
| Genético | Entrega viral de ADN que codifica TERT (Matsushita |
| tratos | (2001) Circ. Res. 89: 793-798; Hooijberg (2000) |
| J. Immunol. 165: 4239-4245); electroporación |
| de plásmido que codifica TERT (Bodnar et al. (1998) |
| Ciencia 279: 349-352); transfección de ARNm |
| codificando TERT (Sæbe-Larssen et al. (2002) |
| J. Immunol. Métodos 259: 191-203) |
| hormonas | Estrógeno (Imanishi et al. (2005) Journal of |
| Hipertensión 23: 1699-1706), eritropoyetina |
| (Akiyama et al. (2011) Leukemia Research 35: |
| 416-418) |
| Físico | Radiación UV (Ueda et al. (1997) Cancer Research |
| tratos | 57: 370-374), hipoxia (Gladych et al. (2011) |
| Bioquímica y Biología Celular 89: 359-376) |
| citocinas | IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-13 e IL-15 (Liu et al. |
| (2010) Revisiones de investigación sobre el envejecimiento 9: 245-256) |
| Pequeña | Resveratrol (Pearce et al. (2008) Oncogene 27: 2365- |
| moléculas | 2374), compuestos extraídos de Astragalus |
| de las plantas | membranaceus incluyendo cicloastragenol (TAT2), |
| TA-65, o (Zvereva et al. (2010) Bioquímica. |
| Biokhimiia 75: 1563-583; Harley et al. (2011) |
| Investigación de rejuvenecimiento 14: 45-56) |
| Otro | Inhibidores de Menina, SIP1 (Lin y Elledge (2003) Cell |
| 113: 881-889), pRB, p38 (Di Mitri et al. (2011) Revista |
| de Inmunología 187: 2093-2100, p53, p73 (Beitzinger |
| et al. (2006) Oncogén 25: 813-826, MKRN1, CHIP, |
| Hsp70 (Lee et al. (2010) The Journal of Biological |
| Chemistry 285: 42033-42045), andrógenos (Nicholls et |
| Alabama. (2011) Protein & Cell 2: 726-738), y TGF-beta |
| (Prade-Houdellier et al. (2007) Leucemia 21: 2304-2310) |
|
Sin embargo, los ejemplos de tratamiento de la Tabla 2 no están exentos de efectos no deseados. Por ejemplo, el tratamiento con factores de crecimiento, hormonas o citoquinas puede causar efectos secundarios, puede activar múltiples vías de señalización, puede provocar una replicación celular no deseada, puede desencadenar una respuesta inmunitaria y, por lo general, no es específico. Los tratamientos genéticos que utilizan plásmidos o virus conllevan un riesgo de modificación genómica por mutagénesis insercional y un riesgo de cáncer. La transfección con ARN no modificado provoca una fuerte respuesta inmunitaria y no se ha demostrado que extienda los telómeros. Los tratamientos físicos pueden dañar el ADN genómico. Se ha descubierto que el tratamiento con moléculas pequeñas de plantas solo extiende los telómeros en algunos sujetos y células, solo extiende los telómeros muy lentamente y requiere una administración crónica, por lo tanto, existe el riesgo de cáncer.
Se ha propuesto que la expresión en células de secuencias de ácido nucleico que codifican hTERT y TERC, y el uso de estos componentes en sí, sean útiles en el diagnóstico, pronóstico y tratamiento de enfermedades humanas (véanse, por ejemplo, las patentes de EE.UU. n.º 5.583.016 y 6.166.178), pero no se ha demostrado la extensión de los telómeros de una manera que sea a la vez rápida y transitoria y, por lo tanto, potencialmente segura por las razones descritas anteriormente. Sebe-Larssen et al. (2002) J. Inmunol. Methods 259:191-203 informó la transfección de células dendríticas con ARNm que codifica hTERT, y que dichas células adquirieron actividad de telomerasa, pero la transfección usó ARNm estándar y resultó en una fuerte respuesta de linfocitos T citotóxicos (CTL) de hTERT en lugar de una extensión de los telómeros. .
Además, todos los tratamientos de moléculas pequeñas existentes son en gran medida ineficaces y lentos (Harley et al. (2011) Rejuvenation Research 14:45-56), principalmente porque actúan a través del componente catalítico de la telomerasa, TERT, que está fuertemente regulado postraduccionalmente. , limitando los efectos de los tratamientos existentes a un pequeño subconjunto de células y excluyendo las células en interfase o GO, como muchas células madre y progenitoras. Cifuentes-Rojas y Shippen (2012) Mutat. Res. 730:20-27; doi:10.1016/j.mrfmmm.2011.10.003; Cong et al. (2002) Revisiones de Microbiología y Biología Molecular66:407-425. Esta regulación está mediada en parte por interacciones entre los componentes del complejo de la telomerasa, el complejo de los telómeros y otras moléculas. Por ejemplo, TERT es fosforilado o desfosforilado en múltiples sitios por múltiples quinasas y fosfatasas, y en algunos sitios, la fosforilación da como resultado un aumento de la actividad de la telomerasa (por ejemplo, la fosforilación por Akt), mientras que en otros sitios la fosforilación reduce la actividad de la telomerasa (por ejemplo, la fosforilación por Src1 o cAbl). Además, TERT se ubiquitina o deubiquitina en sitios específicos. TERT también interactúa con otras proteínas en sitios específicos en TERT, y estas interacciones pueden inactivar TERT (por ejemplo, interacciones con Pinx1 o cAbl), o transportar TERT lejos de los cromosomas (por ejemplo, interacciones con CRM1 y Pinx1), evitando o ralentizando el crecimiento de los telómeros. extensión. Más lejos, algunas proteínas se unen a los telómeros o al complejo de los telómeros, bloqueando TERT (por ejemplo, POT1), impidiendo la extensión de los telómeros. Además, algunas proteínas ayudan indirectamente a la extensión de los telómeros, por ejemplo, las helicasas y UPF1. Debido a los mecanismos reguladores, la actividad de la telomerasa alcanza su punto máximo durante la fase S del ciclo celular y, por lo tanto, las células que se dividen rápidamente tienden a beneficiarse más de los tratamientos que aumentan la actividad de la telomerasa. Sin embargo, a menudo es deseable mantener las células en un estado de división lenta o de no división; por ejemplo, las células madre o progenitoras a menudo se dividen lentamente y, por lo tanto, pueden pasar la mayor parte de su tiempo en interfase o Go. Por lo tanto, los tratamientos existentes son lentos e ineficaces en la mayoría de los tipos de células en general, y en todos los tipos de células durante la interfase y Go. Los tratamientos que son lentos son menos seguros porque requieren un tratamiento más prolongado. Dado que el acortamiento de los telómeros proporciona un mecanismo de seguridad protector contra la proliferación celular descontrolada, como en el caso del cáncer, un tratamiento que extiende los telómeros rápidamente es generalmente más seguro, ya que puede administrarse durante períodos breves y con poca frecuencia, lo que permite que los telómeros se desarrollen normalmente. acortamiento del mecanismo de seguridad para permanecer en efecto durante gran parte del tiempo. Por lo tanto, se necesita un método capaz de superar transitoriamente la regulación de la telomerasa para extender rápidamente los telómeros durante un breve tratamiento.
TERT regula cientos de genes, incluidos los enumerados en la Tabla 3.
| TABLA 3 |
|
| Ejemplos de genes y vías regulados por TERT |
| epigenético | ADN 5-metilcitosina transferasa I (Young et al. |
| Expresar | (2003) El Diario de Química Biológica 278: |
| moduladores | 19904-19908) |
| Proto- | Receptor del factor de crecimiento de hepatocitos (MET), AKT-2, |
| oncogenes | CRK (Perrault et al. (2005) Bioquímica y |
| Comunicaciones de investigación biofísica 335: 925-936) |
| diferente- | Sox-13 (Perrault et al. (2005) Bioquímica y |
| tiación, | Comunicaciones de investigación biofísica 335: 925-936), |
| destino celular | Wnt (Park et al. (2009) Nature 460: 66-72) |
| glucólisis | Fosfofructoquinasa (Bagheri et al. (2006) Proc. Nat'l |
| Academia ciencia USA 103: 11306-11311), aldolasa C |
| (Bagheri et al. (2006) Proc. Nat'l Acad. Sci. |
| EE . UU . 103: 11306-11311) |
| Proliferación | Factor de transcripción activador-3, proteína Xbox-1, |
| potenciadores | FGF, EGFR (Smith et al. (2003) Nature Cell Biology |
| 5: 474-479), factor de crecimiento similar a la insulina 2 (Perrault |
| et al. (2005) Investigación Bioquímica y Biofísica |
| Communications 335: 925-936), Wnt (Park et al. |
| (2009) Nature 460: 66-72), tp53bp1 (Perrault et al. |
| (2005) Investigación Bioquímica y Biofísica |
| Communications 335: 925-936), epirregulina (Lindvall et al. |
| Alabama. (2003) Investigación del cáncer 63: 1743-1747) |
| Metástasis- | Proteína de unión a Mac-2 (Park et al. (2007) International |
| relacionado | Revista de Cáncer 120: 813-820) |
| genes | |
| Proliferación | Antagonista del receptor de interleucina 1, hormona paratiroidea- |
| inhibidores | péptido relacionado, proteína asociada a integrina, TNF- |
| ligando inductor de apoptosis relacionado (Smith et al. (2003) |
| Nature Cell Biology 5: 474-479), proteína de unión a IGF- |
| 5 (Perrault et al. (2005) Bioquímica y Biofísica |
| Research Communications 335: 925-936), Melanoma |
| actividad inhibidora (Perrault et al. (2005) Biochemical |
| y comunicaciones de investigación biofísica 335: |
| 925-936), p21, p53 |
| diferente- | Transformando el factor de crecimiento B2 (Perrault et al. (2005) |
| tiación, | Comunicaciones de investigación bioquímica y biofísica |
| destino celular | 335: 925-936) |
|
En muchos casos, la modulación de los genes o vías de la Tabla 3 no es deseable porque hacerlo puede provocar cambios no deseados en las células. Por ejemplo, TERT activa reguladores epigenéticos, que pueden cambiar el fenotipo celular o interferir con los esfuerzos para reprogramar o transdiferenciar células con fines terapéuticos. TERT activa los potenciadores del crecimiento, pero a menudo no se desea la proliferación, por ejemplo, las células madre con mayor potencial regenerativo son las que se dividen lentamente. TERT modula los reguladores del destino y la diferenciación celular, lo que puede afectar los esfuerzos para diferenciar las células en tipos de células específicos. TERT también activa protooncogenes, lo que podría provocar cáncer. Por lo tanto, es deseable minimizar la cantidad de tiempo durante el cual los niveles de TERT se elevan artificialmente, incluido cualquier tratamiento que extienda los telómeros usando TERT.
En algunos tipos de células, se ha demostrado que TERT afecta la expresión de otros genes (Young et al. (2003) J. Biol. Chem. 278:19904-19908; Perrault et al. (2005) Biochem. Biophys. Res. Commun. 335 :925-936), y esto puede no ser deseable en algunos casos. Por lo tanto, se necesita un tratamiento que minimice la cantidad de tiempo durante el cual aumentan los niveles de TERT.
Compuestos
La presente invención aborda estos problemas proporcionando en un aspecto nuevos compuestos para la expresión transitoria de la telomerasa exógena en una célula. Los compuestos comprenden un ácido ribonucleico sintético que comprende al menos un nucleósido modificado y codifica una transcriptasa inversa de telomerasa (TERT), en el que los telómeros se extienden dentro de una célula tratada con el compuesto.
Ácidos ribonucleicos sintéticos
Los ácidos ribonucleicos usados en la expresión transitoria de TERT según diversos aspectos de la presente invención comprenden un ácido ribonucleico que codifica una proteína TERT. Los ácidos ribonucleicos típicamente comprenden además secuencias que afectan la expresión y/o la estabilidad del ácido ribonucleico en la célula. Por ejemplo, como se muestra enHIGO. 1A, los ácidos ribonucleicos pueden contener una tapa 5' y una región no traducida (UTR) en el lado 5' y/o 3' de la secuencia codificante. Los ácidos ribonucleicos pueden contener además una cola 3', como una cola poli-A. La cola poli-A puede, por ejemplo, aumentar la estabilidad del ácido ribonucleico. En algunas realizaciones, la cola poli-A tiene al menos 75 nucleótidos, 100 nucleótidos, 125 nucleótidos, 150 nucleótidos o incluso más.
En algunas realizaciones, el casquete 5' del ácido ribonucleico es un casquete no inmunogénico. En algunas realizaciones, la tapa 5' puede aumentar la traducción del ácido ribonucleico. En algunas realizaciones, la caperuza 5' se puede tratar con fosfatasa para modular la inmunogenicidad innata del ácido ribonucleico. En algunas realizaciones, el casquete 5' es un análogo de casquete anti-inverso ("ARCA"), tal como un análogo de estructura de casquete de ARN 3'-O-Me-m7G(5')ppp(5')G.
Como es bien sabido en la técnica, las características anteriores, u otras, pueden aumentar la traducción de la proteína TERT codificada por el ácido ribonucleico, pueden mejorar la estabilidad del propio ácido ribonucleico o pueden hacer ambas cosas. En algunas realizaciones, la UTR 5' y/o la UTR 3' son de un gen que tiene un ARNm muy estable y/o un ARNm que se traduce rápidamente, por ejemplo, α-globina o β-globina, c-fos, o el virus del grabado del tabaco. En algunas realizaciones, la UTR 5' y la UTR 3' son de genes diferentes, o son de especies diferentes a las especies a las que se administran las composiciones. Las UTR también pueden ser ensamblajes de partes de UTR de los ARNm de diferentes genes, donde las partes se seleccionan para lograr una cierta combinación de estabilidad y eficiencia de traducción.
Los ácidos ribonucleicos de la invención son preferiblemente ARN modificados con nucleósidos ("modRNA"). La mayoría de las moléculas de ARN maduras en las células eucariotas contienen nucleósidos que son versiones modificadas de los nucleósidos de ARN canónicos no modificados, adenina, citidina, guanosina y uridina. Esas modificaciones pueden evitar que el ARN sea reconocido como un ARN extraño. Karikó et al. (2005) Inmunidad23:165-175. Las moléculas de ARN sintético hechas con ciertos nucleósidos son mucho menos inmunogénicas que el ARN no modificado. La inmunogenicidad se puede reducir aún más mediante la purificación del modRNA sintético, por ejemplo mediante cromatografía líquida de alta resolución (HPLC). Los nucleósidos modificados pueden elegirse, por ejemplo, entre los nucleósidos que se muestran en la Tabla 4. Los nucleósidos son, en algunas realizaciones, pseudouridina, 2-tiouridina o 5-metilcitidina. En algunas circunstancias, puede ser deseable que el ARN modificado conserve cierta inmunogenicidad.
| TABLA 4 |
|
| Nucleósidos modificados encontrados en el ARN eucariótico |
| símbolo | nombre común |
|
| metro 1 A | 1-metiladenosina |
| m 6 A | N 6 -metiladenosina |
| Soy | 2′-O-metiladenosina |
| yo 6 un | N 6 -isopenteniladenosina |
| io 6 A | N 6 -(cis-hidroxiisopentenil)adenosina |
| ms 2 io 6 A | 2-metiltio-N 6 -(cis-hidroxiisopentenil) adenosina |
| g 6 A | N 6 -glicinilcarbamoiladenosina |
| t 6 A | N 6 -treonilcarbamoiladenosina |
| ms 2 t 6 A | 2-metiltio-N 6 -treonil carbamoiladenosina |
| Ar(p) | 2′-O-ribosiladenosina (fosfato) |
| m 6 2 A | N 6 ,N 6 -dimetiladenosina |
| m 6 a. m . | N 6 ,2′-O-dimetiladenosina |
| m 6 2 am | N 6 ,N 6 ,2′-O-trimetiladenosina |
| m 1 am | 1,2′-O-dimetiladenosina |
| m 3 C | 3-metilcitidina |
| m 5 C | 5-metilcitidina |
| Cm | 2′-O-metilcitidina |
| CA 4C _ | N 4 -acetilcitidina |
| F 5C _ | 5-formilcitidina |
| m 4 C | N 4 -metilcitidina |
| hm 5 C | 5-hidroximetilcitidina |
| f 5 cm | 5-formil-2′-O-metilcitidina |
| metro 1G _ | 1-metilguanosina |
| m 2G _ | N 2 -metilguanosina |
| m 7 g | 7-metilguanosina |
| gm | 2′-O-metilguanosina |
| m 2 2 g | N 2 ,N 2 -dimetilguanosina |
| gr(p) | 2′-O-ribosilguanosina (fosfato) |
| yW | wybutosina |
| o 2 años | peroxiwybutosina |
| OHyW | hidroxiwybutosina |
| OHyW* | hidroxiwybutosina submodificada |
| imG | wyosine |
| m 2,7 g | N 2 ,7-dimetilguanosina |
| m 2,2,7G _ | N 2 ,N 2 ,7-trimetilguanosina |
| yo | inosina |
| m 1 yo | 1-metilinosina |
| Yo soy | 2′-O-metilinosina |
| q | cola |
| galQ | galactosil-queuosina |
| hombreQ | manosil-queuosina |
| Ψ | pseudouridina |
| D | dihidrouridina |
| m 5U _ | 5-metiluridina |
| Mmm | 2′-O-metiluridina |
| m 5 um | 5,2′-O-dimetiluridina |
| m 1 Ψ | 1-metilpseudouridina |
| Ψm | 2′-O-metilpseudouridina |
| s 2 u | 2-tiouridina |
| ho 5 tu | 5-hidroxiuridina |
| chm 5 U | 5-(carboxihidroximetil)uridina |
| mchm 5 u | 5-(carboxihidroximetil)uridina metilo |
| | ester |
| mcm 5U _ | 5-metoxicarbonilmetiluridina |
| mcm 5 Um | 5-metoxicarbonilmetil-2′-O-metiluridina |
| mcm 5 s 2 U | 5-metoxicarbonilmetil-2-tiouridina |
| ncm 5U _ | 5-carbamoilmetiluridina |
| ncm 5 Um | 5-carbamoilmetil-2′-O-metiluridina |
| cmnm 5U _ | 5-carboximetilaminometiluridina |
| m 3U _ | 3-metiluridina |
| m 1 acp 3 Ψ | 1-metil-3-(3-amino-3-carboxipropilo) |
| | pseudouridina |
| cm 5U _ | 5-carboximetiluridina |
| m 3 mm | 3,2′-O-dimetiluridina |
| m 5 D | 5-metildihidrouridina |
| τm 5U _ | 5-taurinometiluridina |
| τm 5 s 2 U | 5-taurinometil-2-tiouridina |
|
Sin pretender ceñirse a ninguna teoría, la presencia de los nucleósidos modificados permite que el ARN mod evite la activación de una respuesta inmunitaria mediada por varios receptores, incluidos los receptores tipo Toll y RIG-1. El modRNA no inmunogénico se ha utilizado como agente terapéutico en ratones mediante administración tópica. Kormann et al. (2011) Nature Biotechnology 29:154-157. El descubrimiento del ARNm modificado con nucleótidos facilita el suministro de proteínas terapéuticas codificadas por ARN, o mutantes de las mismas, a las células y la expresión de esas proteínas en las células.
En consecuencia, en algunas realizaciones, los ácidos ribonucleicos de las presentes composiciones comprenden una pseudouridina, una 2-tiouridina, una 5-metilcitidina o un nucleósido de la Tabla 4. En algunas realizaciones, los ácidos ribonucleicos comprenden más de uno de los nucleósidos o combinación de los nucleósidos anteriores. En realizaciones muy preferidas, los ácidos ribonucleicos comprenden pseudouridina y 5-metilcitidina.
En algunas realizaciones, se puede desear una respuesta inmunitaria al ARNmod, y el ARN se puede modificar para inducir un nivel óptimo de inmunidad innata. En otras realizaciones, puede no desearse una respuesta inmunitaria al ARNmod, y el ARN puede modificarse para minimizar tal reacción. El ARN se puede modificar para cualquier situación.
Los ácidos ribonucleicos de la presente invención son preferiblemente ácidos ribonucleicos sintéticos. El término "sintético", como se usa en el presente documento, significa que los ácidos ribonucleicos se preparan en algunas realizaciones usando las herramientas de la biología molecular bajo la dirección de un ser humano, por ejemplo, como se describe a continuación. Los ácidos ribonucleicos sintéticos se pueden preparar, por ejemplo, mediante síntesis in vitro usando extractos celulares o enzimas purificadas y moldes de ácido nucleico. Los ácidos ribonucleicos sintéticos pueden prepararse en algunas realizaciones mediante síntesis química, ya sea parcial o completamente. Alternativamente, o además, los ácidos ribonucleicos sintéticos pueden prepararse en algunas realizaciones mediante expresión manipulada en una célula, seguida de la destrucción de la célula y al menos una purificación parcial del ácido ribonucleico. Sin embargo, un ácido ribonucleico sintético no es
Los ácidos ribonucleicos de la presente invención se pueden preparar usando una variedad de técnicas estándar, como entenderá un experto en la materia. En algunas realizaciones, los ácidos ribonucleicos pueden prepararse mediante síntesis in vitro, como se describe, por ejemplo, en las publicaciones de solicitud de patente de EE. UU. n.º 2009/0286852 y 2011/0143397. En algunas realizaciones, los ácidos ribonucleicos pueden prepararse mediante síntesis química. En algunas realizaciones, los ácidos ribonucleicos pueden prepararse mediante una combinación de síntesis in vitro y síntesis química. Como se ha descrito anteriormente, debe entenderse que el término “sintético” incluye los ácidos ribonucleicos que se preparan ya sea por síntesis química, por síntesis in vitro, por expresión in vivo y al menos purificación parcial, o por una combinación de tales u otros productos químicos. o métodos de biología molecular.
Los ácidos ribonucleicos de la presente invención pueden, en algunas realizaciones, purificarse. Como se indicó anteriormente, la purificación puede reducir la inmunogenicidad de los ácidos ribonucleicos y puede ser ventajosa en algunas circunstancias. Véase también la Publicación de Solicitud de Patente de EE. UU. No. 2011/0143397. En realizaciones preferidas, los ácidos ribonucleicos se purifican por HPLC o por captura y elución por afinidad.
La estructura proteica de TERT incluye al menos tres dominios distintos: una extensión larga en el extremo amino (la extensión N-terminal, NTE) que contiene dominios conservados y una región enlazadora no estructurada; un dominio catalítico de transcriptasa inversa en el medio de la secuencia primaria que incluye siete motivos RT conservados; y una extensión corta en el extremo carboxilo terminal (la extensión C-terminal, CTE). Autexier y Lue (2006) Annu Rev Biochem. 75:493-517. En algunas realizaciones, el ácido ribonucleico de la presente invención codifica un TERT de longitud completa. En algunas realizaciones, el ácido ribonucleico codifica un dominio catalítico de transcriptasa inversa de TERT. En algunas realizaciones, el ácido ribonucleico codifica un polipéptido que tiene actividad TERT.
El TERT codificado por los ácidos ribonucleicos de la presente descripción es preferiblemente un TERT de mamífero, ave, reptil o pez. Más preferiblemente, el TERT es un TERT de mamífero, como el TERT humano. Meyerson et al. (1997) Cell 90:785-795; Nakamura et al. (1997) Science 277:955-959; Mecha et al. (1999) Gen232:97-106. La secuencia de aminoácidos de dos isoformas de TERT humana está disponible como secuencias de referencia del NCBI: NP_937983.2 y NP_001180305.1. Otras secuencias de aminoácidos ejemplares no limitativas codificadas útilmente por los ácidos ribonucleicos de las presentes composiciones incluyen TERT de gato (Secuencia de referencia NCBI: XP_003981636.1), perro (Secuencia de referencia NCBI: NP_001026800.1), ratón (Secuencia de referencia NCBI: NP_033380 .1), vaca (Secuencia de referencia NCBI: NP_001039707.1), oveja Secuencia de referencia NCBI: XP_004017220.1), cerdo (Secuencia de referencia NCBI: NP_001231229.1), elefante africano (Secuencia de referencia NCBI: XP_003408191.1), pollo ( Secuencia de referencia NCBI: NP_001026178.1), rata (Secuencia de referencia NCBI: NP_445875.1), pez cebra (Secuencia de referencia NCBI: NP_001077335.1); medaka japonés (Secuencia de referencia NCBI: NP_001098286.1);
Debe entenderse que los ácidos ribonucleicos de la presente invención pueden codificar variantes de cualquiera de las secuencias de aminoácidos enumeradas anteriormente, particularmente variantes que conservan la actividad catalítica de la telomerasa, incluidas las variantes truncadas. En algunas realizaciones, los ácidos ribonucleicos de las presentes composiciones codifican una de las secuencias de aminoácidos mencionadas anteriormente o una secuencia con al menos un 95 % de identidad de secuencia con esa secuencia. En algunas realizaciones, los ácidos nucleicos de las presentes composiciones codifican una de las secuencias de aminoácidos enumeradas anteriormente o una secuencia con al menos un 98 %, 99 %, 99,9 % o incluso una mayor identidad de secuencia con esa secuencia.
También debe entenderse que los presentes ácidos ribonucleicos pueden corresponder a las secuencias de genes nativos que codifican las proteínas TERT enumeradas anteriormente o pueden corresponder a variantes que son posibles debido a la redundancia del código genético, como se entendería por uno de habilidad ordinaria en el arte. En algunas realizaciones, la selección de codones puede optimizarse para optimizar la expresión de proteínas usando algoritmos y métodos conocidos por los expertos en la técnica. Fat et al. (2011) PLoS ONE 6:3.
Composiciones
En otro aspecto, la presente invención proporciona composiciones para la extensión de los telómeros en una célula, comprendiendo las composiciones un compuesto de la invención, como se describe anteriormente, y un componente adicional. En algunas realizaciones, las composiciones comprenden además un componente de ARN de telomerasa (TERC). (Véase también la Tabla 6 a continuación). En algunas realizaciones, las composiciones comprenden además un vehículo de administración.
Vehículos de reparto
Como se acaba de señalar, las composiciones de la presente descripción pueden comprender además un vehículo de suministro para el ácido ribonucleico. El vehículo de administración puede, en algunos casos, facilitar el direccionamiento y la captación del ácido ribonucleico de la composición a la célula diana. En particular, las composiciones de la presente descripción pueden comprender cualquier vehículo de administración de genes conocido en el campo, por ejemplo, nanopartículas, liposomas, partículas balísticas de armas de genes, virus, lípidos catiónicos, productos comerciales, como Lipofectamine® RNAiMax, u otros vehículos. En algunas realizaciones, el vehículo de administración es un exosoma, una nanopartícula lipídica, una nanopartícula polimérica, una partícula de lipoproteína natural o artificial, un lípido catiónico, una proteína, un complejo de proteína-ácido nucleico, un liposoma, un virosoma o un polímero. En algunas realizaciones preferidas, el vehículo de suministro es una formulación lipídica catiónica. Sin embargo, normalmente no se prefiere la administración viral, ya que puede conducir a una mutagénesis por inserción.
En algunas realizaciones preferidas, el vehículo de administración es un exosoma, una nanopartícula lipídica o una nanopartícula polimérica. En realizaciones muy preferidas, el vehículo de administración es un exosoma. Los exosomas son vesículas de bicapa lipídica de origen natural de 40-100 nm de diámetro. Los exosomas contienen un conjunto de proteínas específicas, incluida la proteína de membrana Lamp-1 y Lamp-2, que son particularmente abundantes. Lakhal y Wood (2011) BioEssays: noticias y reseñas en biología molecular, celular y del desarrollo33:737-741. En 2007, se descubrió que los exosomas son transportadores naturales de ARN y proteínas, incluidos más de 1300 tipos de ARNm y 121 tipos de microARN no codificantes. Los exosomas también pueden transmitir ARNm entre especies: la exposición de células humanas a exosomas de ratón que llevan ARNm de ratón da como resultado la traducción en las células humanas del ARNm de ratón.
Como vehículos de suministro de ARN, proteínas o ADN, los exosomas tienen una serie de ventajas sobre los vehículos alternativos. Específicamente, los exosomas se pueden generar a partir de las propias células de un paciente, lo que los hace no inmunogénicos; por lo tanto, no son atacados por anticuerpos, complemento, factores de coagulación u opsoninas. Además, los exosomas se pueden cargar con ácidos nucleicos mediante electroporación y son vehículos naturales que transportan ARNm y proteínas entre las células humanas. Los exosomas protegen su carga de ARN y proteínas durante el transporte, y la carga se entrega directamente al citosol. Pueden extravasarse del torrente sanguíneo a los tejidos extravasculares, incluso cruzar la barrera hematoencefálica, y pueden ser el objetivo. Además, los exosomas evitan acumularse en órganos no diana como, por ejemplo, el hígado. Por lo tanto, los exosomas pueden usarse como "liposomas" derivados de células para administrar ARNm terapéutico u otra carga en el tratamiento de enfermedades. Mizrak et al. (2013)Terapia Molecular 21:101-108; doi:10.1038/mt.2012.161. En la figura se muestra una ilustración gráfica de un exosoma que entrega un ARNm a una célula.HIGO. 2. Véase también van den Boom et al. (2011) Nature Biotechnology 29:325-326.
Se cree que la mayoría de los tipos de células son capaces de generar exosomas, y los exosomas se encuentran en la mayoría de los fluidos biológicos, incluida la sangre, la saliva, la orina, el líquido cefalorraquídeo, la leche materna y el líquido amniótico. Los exosomas son producidos por la mayoría de los tipos de células, en diferente abundancia. Abundantes exosomas, desprovistos de activadores de células T, pueden derivarse de células dendríticas inmaduras, que están presentes en la sangre humana. O'Doherty et al. (1994) Inmunología 82:487-493. Los exosomas también se pueden producir artificialmente, por ejemplo combinando proteínas exosomales recombinantes con lípidos y fosfolípidos como los que se encuentran en las membranas exosomales. Alternativamente, los exosomas se pueden construir mediante el autoensamblaje in vitro de liposomas con un subconjunto de proteínas de superficie exosómicas.
El potencial de administración de fármacos de los exosomas se demostró por primera vez en 2011. Alvarez-Erviti et al. (2011) Nature Biotechnology 29:341-345. Específicamente, los exosomas se recolectaron de células dendríticas diseñadas para expresar una proteína de fusión Lamp2B fusionada con un ligando de 28 aa de la glicoproteína del virus de la rabia (RVG), luego se sometieron a electroporación de ARNsi en los exosomas y se inyectaron los exosomas en ratones inmunocompatibles con los ratones de los que obtuvieron las células dendríticas. Por tanto, los exosomas eran autólogos y no generaban una respuesta inmunitaria, medida por los niveles de IL-6, IP-10, TNF-α e IFN-α. Además, las dosis repetidas durante un mes provocaron respuestas similares, lo que demuestra que tampoco hubo una respuesta inmunitaria adaptativa.
Como se describió anteriormente, los exosomas pueden ser autólogos y, por lo tanto, tener una baja inmunogenicidad. Dado que el modRNA también tiene baja inmunogenicidad, se prefiere particularmente la combinación de modRNA como ácido ribonucleico y un exosoma como vehículo de administración en las composiciones de la presente descripción. En estas realizaciones, la descripción proporciona una nueva forma de administrar ARNm o ARNmod a células o tejidos, utilizando exosomas. Tal administración proporciona un método útil para aumentar temporalmente el nivel de cualquier proteína en una célula in vivo usando ARN administrado en exosomas por inyección intravenosa o tópica, y particularmente en la administración de un ARN que codifica TERT. Por consiguiente, en realizaciones preferidas, los vehículos de administración de las presentes composiciones no son inmunogénicos. Sin embargo, en algunas circunstancias, puede ser deseable que el vehículo conserve cierta inmunogenicidad.
Componentes adicionales
Las composiciones descritas en el presente documento pueden comprender además componentes adicionales que mejoran el suministro de la composición a la célula diana, mejoran la extensión de los telómeros dentro de la célula, o ambos. Por ejemplo, las composiciones pueden comprender además uno o más de los compuestos y condiciones de la Tabla 2. Como entenderá un experto en la materia, las combinaciones de ingredientes activos a menudo muestran efectos sinérgicos en una actividad deseada, como por ejemplo, para por ejemplo, la expresión transitoria de actividad de telomerasa exógena en una célula, y se entiende que tales combinaciones caen dentro del alcance de la invención. En la Tabla 5 se enumeran ejemplos adicionales de proteínas que pueden incluirse dentro de las composiciones de la presente divulgación. Debe entenderse que las composiciones podrían incluir las propias proteínas,
| TABLA 5 |
|
| Proteínas entregadas útilmente en combinación con TERT |
| Especies | Proteína | Actividad | Ventajas | Referencia |
|
| Humano | UPF1 | Sostiene el telómero | Aumentó | Chawla et al. |
| | filamento principal- | tarifa o | (2011) La OMB |
| | replicación | cantidad de | Diario 30: 4047- |
| | | telómero | 4058 |
| | | extensión. | |
| Humano | HSP90 | Previene | Aumentó | Haendeler et al. |
| | desfosforilación | TERCERO | (2003) FEBRERO |
| | de Akt quinasa por | actividad. | Letras |
| | PP2A. Akt necesita | | 536: 180-186; |
| | ser fosforilado | | Büchner et al. |
| | fosforilar | | (2010) |
| | TERT. también | | Antioxidantes y |
| | complejos con | | Señalización redox |
| | TERT y mantiene | | 13: 551-558 |
| | TERT serina 823 | | |
| | fosforilado, | | |
| | manteniendo TERT | | |
| | activado. buchner | | |
| | et al. (2010) | | |
| | Antioxidantes y | | |
| | Señalización redox | | |
| | 13: 551-558. | | |
| Humano | Akt quinasa | Complejos con | Aumentó | Wojtyla et al. |
| (también conocido como proteína | TERT y HSP90, | TERCERO | (2011) Moléculas |
| quinasa B) | fosforila | actividad. | Informes de biología |
| | TERT en serina | | 38: 3339-3349; |
| | 823, aumentando | | Büchner et al. |
| | actividad TERT. | | (2010) |
| | Büchner et al. | | Antioxidantes y |
| | (2010) | | Señalización redox |
| | Antioxidantes y | | 13: 551-558 |
| | Señalización redox | | |
| | 13: 551-558 | | |
| Humano | proteína quinasa | Fosforilatos | Nuclear | Wojtyla et al. |
| C (PKC) (su | TERT, permitiendo | translocación | (2011) Moléculas |
| varios | para unir nuclear | | Informes de biología |
| isoenzimas) | translocador | | 38: 3339-3349 |
| Humano | Shp-2 | Inhibe | Nuclear | Wojtyla et al. |
| | fosforilación | translocación | (2011) Moléculas |
| | de TERT Y707 por | | Informes de biología |
| | Src1, manteniendo | | 38: 3339-3349 |
| | TERT en el núcleo. | | |
| | Transporte de | | |
| | TERT al núcleo. | | |
| Humano | TPP1 | reclutas | | Abreu et al. |
| | telomerasa a | | (2010) Moléculas |
| | el telómero. | | y celular |
| | | | Biología |
| | | | 30: 2971-2982 |
| Humano | NFKB p65 | Transporte de | Nuclear | Wojtyla et al. |
| | TERT al núcleo. | translocación | (2011) Moléculas |
| | | | Informes de biología |
| | | | 38: 3339-3349 |
| Humano | Rap1 | regulador de | Extensión | O'Connor et al. |
| | longitud de los telómeros. | de telómeros. | (2004) El |
| | | | Diario de |
| | | | Biológico |
| | | | Química |
| | | | 279: 28585-28591 |
|
En la Tabla 6 se enumeran otros ejemplos de agentes que pueden incluirse de manera útil dentro de las composiciones de la presente descripción.
| TABLA 6 |
|
| Otros agentes entregados útilmente en combinación con TERT |
| Molécula | Actividad | Ventajas | Referencia |
|
| Okadaico | Inhibe | Aumentó | Wojtyla et al. |
| ácido | PP2A. PP2A | actividad de la telomerasa | (2011) Moléculas |
| desfosforila | debido a TERT | Informes de biología |
| AKT y o | fosforilación. | 38: 3339-3349 |
| TERT. akt | | |
| fosforila | | |
| TERT, activándolo. | | |
| TERRA | TERRA inhibe | Antisentido TERRA, | Cifuentes-Rojas |
| o anti- | telomerasa por | o ARRET, debe | y enviar |
| sentido TERRA | vinculante para | aumentar la telomerasa | (2012) Mutat. Res. |
| (ARRET) | TERC, a | actividad por unión | 730: 20-27; hacer: |
| cual es | a TERRA, | 10.1016/ |
| complementario. | evitando que | j.mrfmmm.2011.10.003 |
| | vinculante para TERC. | |
| TERC | componente de ARN | Incrementar | |
| ARN | de la telomerasa, | actividad de la telomerasa. | |
| esencial para | | |
| su función, | | |
| puede ser segundo- | | |
| más limitante | | |
| factor después | | |
| TERT en la mayoría | | |
| células. |
|
Dado que TERT es más activo durante ciertas fases del ciclo celular, las composiciones de la presente divulgación también pueden incluir opcionalmente uno o más activadores transitorios de proliferación celular, para mejorar la eficacia del tratamiento TERT. Dichos agentes pueden incluir, por ejemplo, un agente de ARNi que reduce transitoriamente las cantidades de inhibidores del ciclo celular tales como Rb o P19/Arf en la célula. Otros activadores transitorios de la proliferación celular pueden incluirse de manera útil en las presentes composiciones, como comprenderá un experto en la materia.
Métodos de extensión de los telómeros y métodos de tratamiento
En otro aspecto, la presente descripción proporciona métodos para extender los telómeros, que comprenden el paso de administrar cualquiera de los compuestos o composiciones descritos anteriormente a una célula con telómeros acortados, donde los telómeros se extienden dentro de la célula. La presente descripción también proporciona métodos de tratamiento, que comprenden el paso de administrar cualquiera de los compuestos o composiciones descritos anteriormente a un sujeto animal que necesita, o que puede beneficiarse de, la extensión de los telómeros.
En realizaciones preferidas, los compuestos o composiciones se administran a una célula, donde la célula es una célula aislada o es parte de un cultivo celular, un cultivo de tejido aislado, un órgano aislado o similar (es decir, la administración es in vitro) .
En otras realizaciones preferidas, los compuestos o composiciones se administran sin aislar la célula o células, el tejido o el órgano del sujeto (es decir, la administración es in vivo). En algunas de estas realizaciones, el compuesto o composición se administra a todas, o casi todas, las células del cuerpo del sujeto. En algunas realizaciones, el compuesto o composición se administra a una célula o tejido específico en el cuerpo del sujeto.
En algunas realizaciones, el sujeto es un mamífero, ave, pez o reptil. En realizaciones preferidas, el sujeto es un mamífero y más preferiblemente un ser humano. En otras realizaciones preferidas, el sujeto es un animal de compañía, un animal de zoológico, un animal de ganado o una especie animal en peligro de extinción. En la Tabla 7 se enumeran ejemplos de especies objeto preferidas.
| TABLA 7 |
|
| Especies animales objeto. |
|
|
| Perro ( Canis lupus familiaris ) |
| Ovejas ( Ovis aries ) |
| Cerdo doméstico ( Sus scrofa domesticus ) |
| Cabra doméstica ( Capra aegagrus hircus ) |
| Bovino ( Bos primigenius taurus ) |
| Cebú ( Bos primigenius indicus ) |
| Gato ( Felis catus ) |
| Pollo ( Gallus gallus domesticus ) |
| Cuy ( Cavia porcellus ) |
| Burro ( Equus africanus asinus ) |
| Pato domesticado ( Anas platyrhynchos domesticus ) |
| Búfalo de agua ( Bubalus bubalis ) |
| Caballo ( Equus ferus caballus ) |
| Polilla de seda domesticada ( Bombyx mori ) |
| Paloma doméstica ( Columba livia domestica ) |
| Ganso doméstico ( Anser anser domesticus ) |
| Llama ( Lama glama ) |
| Alpaca ( Vicugna pacos ) |
| Gallina de Guinea domesticada ( Numida meleagris ) |
| Hurón ( Mustela putorius furo ) |
| Paloma Ringneck ( Streptopelia risoria ) |
| Ganado de Bali ( Bos javanicus domestica ) |
| Gayal ( Bos frontalis ) |
| Pavo domesticado ( Meleagris gallopavo ) |
| Pez dorado ( Carassius auratus auratus ) |
| Conejo doméstico ( Oryctolagus cuniculus ) |
| Canario doméstico ( Serinus canaria domestica) |
| Carabao ( Bubalus bubalis carabenesis) |
| Pez luchador siamés ( Betta splendens ) |
| Koi ( Cyprinus carpio haematopterus) |
| Zorro plateado domesticado ( Vulpes vulpes ) |
| Erizo domesticado ( Atelerix albiventris ) |
| Pinzón de sociedad ( Lonchura striata domestica ) |
| Yac ( Bos grunniens ) |
| Rata elegante y rata de laboratorio |
| Camello dromedario domesticado ( Camelus dromedarius ) |
| Camello bactriano domesticado ( Camelus bactrianus ) |
| Guppy ( Poecilia reticulata algunas cepas) |
| Ratón elegante |
|
Para aplicaciones in vitro, los compuestos o composiciones pueden administrarse utilizando cualquier técnica adecuada, como entenderán los expertos en los campos de la biología celular, cultivo celular, cultivo de tejidos, cultivo de órganos o similares. Para aplicaciones in vivo, los compuestos o composiciones se administran útilmente mediante inyección, aplicación tópica, inhalación o cualquier otra técnica de administración adecuada, como entenderán los expertos en la técnica médica o similares.
Como se describió anteriormente, las células tratadas de manera útil de acuerdo con los métodos de la divulgación incluyen células, ya sea en un sujeto (para administración in vivo) o de un sujeto (para administración in vitro), que pueden beneficiarse de la extensión de los telómeros. Dado que los telómeros cortos afectan a casi todos los tipos de células en la mayoría de los animales, la extensión de los telómeros puede beneficiar a la mayoría de los animales. Un tratamiento de extensión de telómeros que sea transitorio y breve tiene el potencial de ser seguro, como se describió anteriormente. Por lo tanto, la extensión de los telómeros utilizando un tratamiento transitorio, como se describe en el presente documento, puede ser útil en todos o en la mayoría de las personas, ya sea como medida preventiva, por ejemplo, para prevenir o retrasar la aparición de muchas enfermedades y afecciones en las que están implicados los telómeros cortos, o como tratamiento para esas enfermedades y condiciones. El tratamiento puede beneficiar a sujetos con riesgo de enfermedades o condiciones relacionadas con la edad, o que ya padecen dichas enfermedades, y también puede beneficiar a sujetos que han experimentado, están experimentando o corren el riesgo de experimentar un trauma físico o estrés físico crónico como ejercicio duro o trabajo manual, o trauma psicológico o estrés psicológico crónico, ya que todas estas condiciones causan acortamiento de los telómeros; el estrés físico o el trauma requieren la división celular para reparar el daño resultante, acortando así los telómeros, y estas condiciones también pueden causar estrés oxidativo, que también acorta los telómeros. Dichas enfermedades y condiciones incluyen, por ejemplo, síndrome metabólico, diabetes, úlceras diabéticas, enfermedades cardíacas, muchas formas de cáncer, demencia vascular, Alzheimer, accidente cerebrovascular, degeneración macular relacionada con la edad,
Las células tratadas de manera útil de acuerdo con los presentes métodos también pueden incluir células en o de un sujeto que padece una enfermedad o afección relacionada con la edad o que está en riesgo de padecer dicha enfermedad o afección. Dichas enfermedades y condiciones relacionadas con la edad pueden incluir enfermedades genéticas en las que los genes que codifican componentes del complejo de telomerasa o del complejo de telómero están mutados, lo que conduce a telómeros cortos. Dichas enfermedades incluyen, por ejemplo, formas de fibrosis pulmonar idiopática, disqueratosis congénita y anemia aplásica.
Por lo tanto, en el caso de enfermedades genéticas, las composiciones pueden incluir además ácidos nucleicos adicionales, como las versiones funcionales normales de las secuencias de codificación de los genes que se ven afectados por tales enfermedades, por ejemplo, DKC1, TINF2, NOP10, NHP2, TERC, u otros genes. En la Tabla 8 se enumeran ejemplos de dichos genes. Véase también Armanios (2009) Ann. Rev. Genómica Hum. Gineta. 10: 45-61.
| TABLA 8 |
|
| Genes relacionados con enfermedades relacionadas con la edad. |
| | | Edad de inicio en |
| Gene | Diagnóstico | años (típico) |
|
| HTR | FPI esporádica 1-3% | Amplia gama de |
| hTERT | FPI familiar 8-15% | edades 5-77 |
| | Esporádico y familiar | |
| | anemia aplásica ~3-5% | |
| | Dominante autosómico | |
| | disqueratosis congénita | |
| | (CORRIENTE CONTINUA) | |
| DKC1 | CC ligada al X | menos de 30 |
| | Hoyeraal-Hreiderasson | Menos de 5 |
| TINF2 | CC esporádica | Menos de 10 |
| | DC autosómica dominante | — |
| | Hoyeraal-Hreiderasson | Menos de 5 |
| NOP10 | DC autosómico recesivo | — |
| NHP2 | DC autosómico recesivo | — |
|
Además, el tratamiento puede beneficiar a sujetos que padecen o corren el riesgo de sufrir otro tipo de enfermedades genéticas en las que los telómeros cortos pueden desempeñar un papel, como, por ejemplo, la distrofia muscular. En tales enfermedades, la necesidad de replicación celular para abordar el problema causado por la mutación genética acorta los telómeros más rápidamente de lo normal, lo que resulta en un acortamiento de los telómeros más rápido de lo normal, lo que a su vez agota la capacidad de replicación de las células, lo que lleva a una disfunción tisular, exacerbada o síntomas adicionales, discapacidad y, a menudo, la muerte. Además, se pueden prevenir o retrasar varios tipos de cáncer mediante el tratamiento con compuestos de la invención y, de hecho, se cree que las fusiones cromosoma-cromosoma provocadas por telómeros críticamente cortos son una causa de cáncer. Los telómeros también pueden alargarse selectivamente en células sanas de un individuo, sin alargar los telómeros en las células cancerosas, lo que puede permitir el uso de los presentes compuestos, composiciones y métodos, por ejemplo, para alargar los telómeros del sistema inmunitario para aumentar su capacidad para combatir el cáncer. Además, las células del sistema inmunitario se pueden recolectar de un individuo para el tratamiento utilizando la invención ex vivo seguido de la reintroducción en el individuo.
En algunas realizaciones, las células tratadas según los presentes métodos son de sujetos en los que todavía no se manifiesta ningún estado de enfermedad pero en los que el sujeto corre el riesgo de padecer una afección o enfermedad que implica telómeros cortos, o en los que las células contienen telómeros acortados. En algunas realizaciones, la enfermedad relacionada con la edad es simplemente la vejez. Los tratamientos instantáneos también se pueden usar como una ayuda cosmética para prevenir, retrasar o mejorar el deterioro relacionado con la edad en la apariencia de la piel, el cabello, la estructura ósea, la postura, la claridad de los ojos u otros rasgos que disminuyen con el envejecimiento. Por ejemplo, los tratamientos pueden usarse para ayudar a mantener la elasticidad, el grosor, la tersura y la apariencia de la piel, ya que la extensión de los telómeros mejora estos parámetros. En los casos de traumatismo físico, como una fractura de hueso o un aplastamiento de tejido o lesión por corte o quemadura, la invención se puede utilizar para aumentar la longitud de los telómeros en las células que participan en la curación del trauma, para aumentar su capacidad de replicación. En casos de estrés físico crónico, que provoca el acortamiento de los telómeros, el tratamiento con la invención puede alargar los telómeros en las células afectadas aumentando su capacidad de replicación y capacidad para reparar el daño tisular. Dado que el acortamiento de los telómeros se acumula durante generaciones, por ejemplo en humanos con haploinsuficiencia de los componentes de la telomerasa como hTR o hTERT, Armanios (2009)año Rev. Genómica Hum. Gineta. 10:45-61, los tratamientos de la presente divulgación pueden aplicarse a células de línea germinal tales como óvulos, espermatozoides o sus precursores, oa óvulos o embriones fertilizados, por ejemplo, durante procedimientos de fertilización in vitro. Los tratamientos también pueden ser útiles para ayudar a otros tratamientos de diversas enfermedades o afecciones, por ejemplo, la transdiferenciación de células in vivo. Los métodos de tratamiento también pueden ser útiles antes o durante la cirugía, la quimioterapia o la radioterapia, para aumentar la capacidad de replicación de las células para reparar el daño resultante de estos procedimientos.
Los métodos también pueden ser útiles para tratar células in vitro para diversas aplicaciones, incluida la terapia celular autóloga o heteróloga, bioingeniería, ingeniería de tejidos, crecimiento de órganos artificiales, generación de células madre pluripotentes inducidas (iPSC) y diferenciación celular, desdiferenciación o transdiferenciación. . En estas aplicaciones, puede ser necesario que las células se dividan muchas veces, lo que puede conducir a la pérdida de la longitud de los telómeros, lo que puede ser contrarrestado por la invención antes, durante o después de la aplicación.
Además, varios tipos de cáncer pueden considerarse enfermedades relacionadas con la edad, particularmente cuando las células cancerosas contienen telómeros cortos. En algunos casos, las células tratadas de acuerdo con los presentes métodos proceden de sujetos en los que todavía no se manifiesta ningún estado de enfermedad pero en los que las células contienen telómeros acortados. En algunas realizaciones, la enfermedad relacionada con la edad es simplemente la forma y función alteradas típicamente asociadas con la edad cronológica avanzada en humanos.
Los compuestos o composiciones de la presente divulgación administrados de manera útil a las células de acuerdo con los métodos de la presente incluyen células de cualquier tejido o tipo de célula que pueden sufrir los efectos de telómeros acortados o que pueden beneficiarse de alguna manera del alargamiento de los telómeros de la célula. Las células pueden incluir células somáticas o células germinales, así como células madre y otras células progenitoras y/o células indiferenciadas. Las células pueden incluir células tumorales y células no tumorales.
Los ejemplos de compuestos o composiciones administrados de forma útil a las células de acuerdo con los presentes métodos incluyen células que se derivan principalmente del endodermo, células que se derivan principalmente del ectodermo y células que se derivan principalmente del mesodermo. Las células derivadas principalmente del endodermo incluyen, por ejemplo, células epiteliales secretoras exocrinas y células secretoras de hormonas. Las células derivadas principalmente del ectodermo incluyen, por ejemplo, células del sistema tegumentario (p. ej., células epiteliales queratinizantes y células epiteliales de barrera estratificada húmeda) y del sistema nervioso (p. ej., células transductoras sensoriales, células de neuronas autónomas, órganos de los sentidos y neuronas periféricas que soportan células, neuronas del sistema nervioso central y células gliales, y células del cristalino). Las células derivadas principalmente del mesodermo incluyen, por ejemplo, células metabólicas y de almacenamiento, células con función de barrera (p. ej., células del pulmón, intestino, glándulas exocrinas y tracto urogenital), células de la matriz extracelular, células contráctiles, células sanguíneas y del sistema inmunitario, células germinales, células nodrizas y células intersticiales. Por consiguiente, en algunas realizaciones de los presentes métodos, la célula a la que se administra la composición es una célula somática de linaje endodérmico, mesodérmico o ectodérmico. En algunas realizaciones, la célula es una célula de línea germinal o una célula embrionaria.
Los ejemplos específicos de células a las que se puede administrar un compuesto o composición de acuerdo con los presentes métodos incluyen, por ejemplo, células mucosas de glándulas salivales, células serosas de glándulas salivales, células de glándulas de von Ebner en la lengua, células de glándulas mamarias, células de glándulas lagrimales, células de glándulas ceruminosas en oído, células oscuras de las glándulas sudoríparas ecrinas, células claras de las glándulas sudoríparas ecrinas, células de las glándulas sudoríparas apocrinas, células de las glándulas de Moll en el párpado, células de las glándulas sebáceas, células de las glándulas de Bowman en la nariz, células de las glándulas de Brunner en el duodeno, células de las vesículas seminales, células de la glándula prostática, células de las glándulas bulbouretrales, células de las glándulas de Bartholin, células de las glándulas de Littre, células del endometrio del útero, células caliciformes aisladas de los tractos respiratorio y digestivo, células mucosas del revestimiento del estómago, células zimógenas de las glándulas gástricas, células oxínticas de las glándulas gástricas, células acinares pancreáticas,células de Paneth del intestino delgado, neumocitos tipo II del pulmón, células claras del pulmón, células de la hipófisis anterior (p. ej., somatotropas, lactotropas, tirotropas, gonadotropas y corticotropas), células pituitarias intermedias (p. ej., las que secretan la hormona estimulante de los melanocitos ), células neurosecretoras magnocelulares (p. ej., las que secretan oxitocina o vasopresina), células intestinales y del tracto respiratorio (p. ej., las que secretan serotonina, endorfina, somatostatina, gastrina, secretina, colecistoquinina, insulina, glucagón o bombesina), células de la glándula tiroides ( ej., células epiteliales de la tiroides y células parafoliculares), células de la glándula paratiroides (p. ej., células principales de la paratiroides y células oxífilas), células de la glándula suprarrenal (p. ej., células cromafines y células que secretan hormonas esteroides como mineralcorticoides y glucocorticoides), células de Leydig de los testículos,células de la teca interna del folículo ovárico, células del cuerpo lúteo del folículo ovárico roto, células luteínicas de la granulosa, células luteínicas de la teca, células yuxtaglomerulares, células de la mácula densa del riñón, células peripolares del riñón, células mesangiales del riñón, queratinocitos epidérmicos, células basales epidérmicas, queratinocitos de las uñas de las manos y los pies, células basales del lecho ungueal, células del tallo del cabello medular, células del tallo del cabello cortical, células del tallo del cabello cuticular, células de la vaina de la raíz del cabello cuticular, células de la vaina de la raíz del cabello de la capa de Huxley, células de la vaina de la raíz del cabello de Henle capa, células de la vaina externa de la raíz del cabello, células de la matriz del cabello, células epiteliales superficiales del epitelio escamoso estratificado de la córnea, lengua, cavidad oral, esófago, canal anal, uretra distal y vagina, células basales del epitelio de la córnea, lengua , cavidad oral,esófago, conducto anal, uretra distal y vagina, células del epitelio urinario (p. ej., que recubren la vejiga urinaria y los conductos urinarios), células ciliadas internas auditivas del órgano de Corti, células ciliadas externas auditivas del órgano de Corti, células basales del epitelio olfativo, neuronas sensoriales primarias sensibles al frío, neuronas sensoriales primarias sensibles al calor, células de Merkel de la epidermis, neuronas receptoras olfativas, neuronas sensoriales primarias sensibles al dolor, células fotorreceptoras de la retina en el ojo (p. células cónicas sensibles al azul, células cónicas sensibles al verde fotorreceptoras y células cónicas sensibles al rojo fotorreceptoras), neuronas sensoriales primarias propioceptivas, neuronas sensoriales primarias sensibles al tacto, células del cuerpo carotídeo tipo I y II, células ciliadas tipo I y II del aparato vestibular del oído, células de la papila gustativa tipo I,células neurales colinérgicas, células neurales adrenérgicas, células neurales peptidérgicas, células de los pilares internos y externos del órgano de Corti, células de las falanges internas y externas del órgano de Corti, células fronterizas del órgano de Corti, células de Hensen del órgano de Corti, células de soporte del aparato vestibular, células de soporte del botón gustativo, células de soporte del epitelio olfativo, células de Schwann, células gliales satélite, células gliales entéricas, astrocitos, células neuronales, oligodendrocitos, neuronas fusiformes, células epiteliales del cristalino anterior, células de fibra del cristalino que contienen cristalino, hepatocitos, adipocitos (p. ej., células de grasa blanca y células de grasa parda), lipocitos de hígado, células parietales de riñón, podocitos de glomérulo de riñón, células del borde en cepillo del túbulo proximal de riñón, células del segmento delgado del asa de Henle, células del túbulo distal de riñón, células del conducto colector renal, tipo I neumocitos,células del conducto pancreático, células del conducto no estriado (p. ej., células principales y células intercaladas), células del conducto (de vesícula seminal, glándula prostática, etc.), células del borde en cepillo intestinal (con microvellosidades), células del conducto estriado de la glándula exocrina, células epiteliales de la vesícula biliar , células no ciliadas del ductulus efferens, células principales del epidídimo, células basales del epidídimo, células epiteliales del ameloblasto, células epiteliales del plano semilunatum del aparato vestibular del oído, órgano deplanum semilunatum células epiteliales del aparato vestibular del oído, órgano deplanum semilunatum células epiteliales del aparato vestibular del oído, órgano deCortícélulas epiteliales interdentales, fibroblastos de tejido conjuntivo laxo, fibroblastos corneales (queratocitos corneales), fibroblastos tendinosos, fibroblastos de tejido reticular de la médula ósea, otros fibroblastos no epiteliales, pericitos, células del núcleo pulposo del disco intervertebral, cementoblastos/cementocitos, odontoblastos/odontocitos, condrocitos de cartílago hialino , condrocitos de fibrocartílago, condrocitos de cartílago elástico, osteoblastos/osteocitos, células osteoprogenitoras, hialocitos del cuerpo vítreo del ojo, células estrelladas del espacio perilinfático del oído, células estrelladas hepáticas (células de Ito), células estelares pancreáticas, células del músculo esquelético ( ej., células musculares esqueléticas rojas (lentas) y células musculares esqueléticas blancas (rápidas), células musculares esqueléticas intermedias, células en bolsa nuclear del huso muscular, células en cadena nuclear del huso muscular, células satélite,células del músculo cardíaco (p. ej., células del músculo cardíaco ordinarias, células del músculo cardíaco nodular y células de fibra de Purkinje, células del músculo liso (varios tipos), células mioepiteliales del iris, células mioepiteliales de las glándulas exocrinas, eritrocitos, megacariocitos, monocitos, tejido conjuntivo macrófagos (varios tipos), células epidérmicas de Langerhans, osteoclastos, células dendríticas, células microgliales, granulocitos neutrófilos, granulocitos eosinófilos, granulocitos basófilos, células de hibridoma, mastocitos, células T auxiliares, células T supresoras, células T citotóxicas, células T asesinas naturales, Células B, células asesinas naturales, reticulocitos, células madre y progenitores comprometidos para la sangre y el sistema inmunitario (varios tipos), ovogonios/ovocitos, espermátidas, espermatocitos, células de espermatogonio, espermatozoides, células nodrizas, células de folículo ovárico, células de sertoli, células epiteliales del timo células,y células renales intersticiales.
En una realización preferida, las células a las que se administra un compuesto o composición según los presentes métodos son células madre o progenitoras, ya que estas células dan lugar a otras células del cuerpo. En otra realización preferida, las células tratadas son células en las que los telómeros se acortan más rápidamente que en otros tipos de células, por ejemplo, células endoteliales, fibroblastos, queratinocitos, células del sistema inmunológico incluyendo células tiroideas y paratiroideas y leucocitos y sus progenitores, células del intestinos, hígado, células de la membrana mucosa, por ejemplo, en el esófago y el colon, y células de las encías y la pulpa dental.
Por consiguiente, en algunas realizaciones, las células son células de fibroblastos, queratinocitos, células endoteliales, células epiteliales o células sanguíneas.
El paso de administración se puede realizar una o más veces dependiendo de la cantidad de extensión de telómero deseada. En algunas realizaciones de los métodos instantáneos, la célula es una célula aislada, y el paso de administración no dura más de 96 horas, no más de 72 horas, no más de 48 horas, no más de 36 horas, no más de 24 horas, no más de 18 horas, no más de 12 horas, no más de 8 horas, no más de 4 horas, o incluso tiempos más cortos. En algunas realizaciones, el paso de administración dura al menos 2 horas, al menos 4 horas, al menos 8 horas, al menos 12 horas, al menos 18 horas, al menos 24 horas, al menos 36 horas, al menos 48 horas o incluso tiempos más largos. En realizaciones preferidas, el paso de administración no dura más de 48 horas, no más de 96 horas o no más de 1 semana. En otras realizaciones preferidas, la etapa de administración dura al menos 2 horas. Debe entenderse que, en el caso de que la administración sea por transfección, el tiempo de administración incluye el tiempo para que la célula se recupere del método de transfección.
En algunas realizaciones de los métodos instantáneos, la célula es una célula aislada y el paso de administración se realiza no más de 6 veces, no más de 5 veces, no más de 4 veces, no más de 3 veces, no más de 2 veces , o incluso no más de 1 vez. En algunas realizaciones, el paso de administración se realiza no menos de 2 veces, no menos de 3 veces, no menos de 4 veces, no menos de 5 veces, no menos de 6 veces o incluso más a menudo.
En algunas realizaciones, el paso de administración se realiza una o varias veces durante un período relativamente breve para volver a extender los telómeros, y luego no se realiza durante un período prolongado hasta que los telómeros necesitan extenderse nuevamente. Este ciclo puede repetirse indefinidamente. Dicho programa de tratamiento permite que los telómeros se vuelvan a extender periódicamente, con intervalos entre los pasos de administración durante los cuales los telómeros se acortan. Los métodos de tratamiento periódicos pueden realizarse mediante administración in vivo o mediante administración in vitro, según se desee. En algunas realizaciones, el paso de administración en dicha serie se realiza no más de 6 veces, no más de 5 veces, no más de 4 veces, no más de 3 veces, no más de 2 veces o incluso no más de 1 vez. . En algunas realizaciones, el paso de administración se realiza no menos de 2 veces, no menos de 3 veces, no menos de 4 veces, no menos de 5 veces, no menos de 6 veces, o incluso más a menudo. Variando el número de veces que se realiza el paso de administración y la dosis de los compuestos que se usan en nuestras composiciones de la invención, se puede controlar la cantidad de extensión de los telómeros lograda.
En algunas realizaciones, los métodos de la presente descripción incluyen además el paso de cultivar la célula en un sustrato específico, preferiblemente un sustrato elástico. Se sabe que tales sustratos previenen cambios no deseados en la célula que normalmente ocurrirían en otros sustratos debido a la elasticidad no fisiológica de esos sustratos. Véase la Publicación Internacional PCT No. WO2012/009682, que se incorpora aquí como referencia en su totalidad. Los sustratos elásticos también pueden promover la supervivencia celular.
La administración de los compuestos o composiciones de la presente descripción da como resultado la expresión transitoria de una actividad de telomerasa en la célula. El aumento de la actividad se mide fácilmente mediante varios ensayos, como, por ejemplo, el kit de detección de telomerasa Trapeze® RT (Millipore), que proporciona un ensayo in vitro sensible en tiempo real que usa detección fluorimétrica y cuantificación de la actividad de la telomerasa, aunque otras medidas Las técnicas también son posibles. En algunas realizaciones, la actividad de la telomerasa aumenta al menos un 5 %, al menos un 10 %, al menos un 20 %, al menos un 30 %, al menos un 50 % o incluso más. En realizaciones preferidas, la actividad de la telomerasa aumenta al menos un 5%.
Como se indicó anteriormente, una de las ventajas de las presentes técnicas es que la expresión de la actividad de la telomerasa es transitoria en las células tratadas. En particular, dicha expresión transitoria contrasta con las técnicas anteriores en las que se inserta un gen de transcriptasa inversa de telomerasa en la secuencia genómica de la célula o modifica permanentemente la estructura genética de la célula objetivo y da como resultado una actividad constitutiva de la secuencia de ácido nucleico. .
HIGO. 3ilustra gráficamente algunas de las ventajas de los compuestos, composiciones y métodos descritos en este documento. En particular, la velocidad de extensión de los telómeros que se hace posible con estos compuestos, composiciones y métodos permite el mantenimiento de los telómeros mediante la administración muy poco frecuente de ARNmod de TERT. La actividad de la telomerasa expresada extiende rápidamente los telómeros en un breve período, antes de ser invertido, lo que permite que el mecanismo protector anticancerígeno del acortamiento de los telómeros funcione la mayor parte del tiempo. Entre tratamientos, la actividad normal de la telomerasa y el acortamiento de los telómeros están presentes y, por lo tanto, el mecanismo de seguridad anticancerígeno del acortamiento de los telómeros para evitar la proliferación descontrolada permanece intacto, mientras que el riesgo de enfermedad relacionada con los telómeros cortos permanece bajo. A diferencia de,
Por consiguiente, en algunas realizaciones de los presentes métodos, la expresión de la actividad de la transcriptasa inversa de la telomerasa, es decir, la vida media de la actividad de la telomerasa, dura no más de 48 horas, no más de 36 horas, no más de 24 horas, no más de 18 horas, no más de 12 horas, no más de 8 horas, no más de 4 horas o incluso tiempos más cortos. En algunas realizaciones, la expresión de la actividad transcriptasa inversa de la telomerasa dura al menos 2 horas, al menos 4 horas, al menos 8 horas, al menos 12 horas, al menos 18 horas, al menos 24 horas, al menos 36 horas, al menos 48 horas. horas, o incluso tiempos más largos. En realizaciones preferidas, la expresión de la actividad transcriptasa inversa de la telomerasa no dura más de 48 horas. En otras realizaciones preferidas, la expresión de la actividad transcriptasa inversa de la telomerasa dura al menos 2 horas.
En algunas realizaciones de los métodos instantáneos, la expresión transitoria es independiente del ciclo celular.
Como se señaló anteriormente, la expresión transitoria de la transcriptasa inversa de la telomerasa da como resultado la extensión de los telómeros acortados en las células tratadas. La longitud de los telómeros se puede medir fácilmente utilizando técnicas como el análisis de la longitud del fragmento de restricción terminal (TRF), qPCR, MMqPCR y Q-FISH, como comprenderá un experto en la materia. Véase, por ejemplo, Kimura et al. (2010) Protocolo Nacional. 5:1596-607; doi: 10.1038/nprot.2010.124. En algunas realizaciones, los métodos instantáneos aumentan la longitud de los telómeros en las células tratadas en al menos 0,1 kb, al menos 0,2 kb, al menos 0,3 kb, al menos 0,4 kb, al menos 0,5 kb, al menos 1 kb, al menos 2 kb, al menos al menos 3 kb, al menos 4 kb, al menos 5 kb o incluso más.
Una de las ventajas de los presentes compuestos, composiciones y métodos es la rapidez de extensión de los telómeros conseguida por estas técnicas. Las técnicas permiten que los tratamientos sean breves y, por lo tanto, seguros porque el mecanismo protector normal de acortamiento de los telómeros permanece intacto la mayor parte del tiempo. El tratamiento con los compuestos y las composiciones descritas en el presente dan como resultado la entrega de decenas o cientos de copias de ARNm de TERT por célula, según lo medido por RT-qPCR absoluta, que es sustancialmente mayor que el número promedio de copias de ARNm de TERT endógeno encontrado incluso en células con alta actividad de la telomerasa. Por lo general, estas células tienen menos de una copia de ARNm de TERT por célula (Yi et al. (2001) Nucl. Acids Res.29:4818-4825). Por lo tanto, los tratamientos introducen transitoriamente una gran cantidad de copias de modRNA que codifica TERT en una célula, lo que resulta en una rápida extensión de los telómeros. Sin pretender limitarse a la teoría, la gran cantidad de copias de modRNA que codifican TERT pueden abrumar transitoriamente los mecanismos reguladores inhibitorios que normalmente evitan que TERT y otros métodos de extensión de telómeros extiendan los telómeros tan rápido como los compuestos, las composiciones y los métodos descritos. Aquí en.
La expresión transitoria de la transcriptasa inversa de la telomerasa también da como resultado una mayor capacidad de replicación en las células tratadas. La capacidad replicativa aumentada se controla fácilmente en células que se acercan a la senescencia replicativa midiendo duplicaciones de población adicionales en dichas células. Las células senescentes no se estimulan para dividirse mediante pases en cultivo o tratamiento con suero. Las células senescentes se caracterizan además a menudo por la expresión de la actividad de β-galactosidasa dependiente del pH, la expresión de los inhibidores del ciclo celular p53 y p19, y otros patrones alterados de expresión génica, y un tamaño celular agrandado. En ausencia de tratamiento con los compuestos y composiciones de la presente descripción, las células de fibroblastos de pulmón humano normalmente se duplican 50-60 veces. Sin embargo, con un conjunto de uno a tres tratamientos que duran solo unos pocos días en total, estas células logran una población adicional de 16-28 duplicaciones. Si se vuelve a tratar varias semanas después, se confiere nuevamente capacidad proliferativa adicional. Este proceso de tratamientos intermitentes para volver a extender periódicamente los telómeros se puede aplicar veces adicionales, y el intervalo entre tratamientos depende de factores como la tasa de acortamiento de los telómeros, la tasa de divisiones celulares y la cantidad de extensión de los telómeros proporcionada por el tratamiento. Asimismo, las células endoteliales dérmicas microvasculares humanas de un individuo anciano, en ausencia de tratamiento con las presentes composiciones, pueden lograr solo 1-2 duplicaciones de población, mientras que las células tratadas pueden lograr 3, 4 o incluso más duplicaciones de población. Este proceso de tratamientos intermitentes para volver a extender periódicamente los telómeros se puede aplicar veces adicionales, y el intervalo entre tratamientos depende de factores como la tasa de acortamiento de los telómeros, la tasa de divisiones celulares y la cantidad de extensión de los telómeros proporcionada por el tratamiento. Asimismo, las células endoteliales dérmicas microvasculares humanas de un individuo anciano, en ausencia de tratamiento con las presentes composiciones, pueden lograr solo 1-2 duplicaciones de población, mientras que las células tratadas pueden lograr 3, 4 o incluso más duplicaciones de población. Este proceso de tratamientos intermitentes para volver a extender periódicamente los telómeros se puede aplicar veces adicionales, y el intervalo entre tratamientos depende de factores como la tasa de acortamiento de los telómeros, la tasa de divisiones celulares y la cantidad de extensión de los telómeros proporcionada por el tratamiento. Asimismo, las células endoteliales dérmicas microvasculares humanas de un individuo anciano, en ausencia de tratamiento con las presentes composiciones, pueden lograr solo 1-2 duplicaciones de población, mientras que las células tratadas pueden lograr 3, 4 o incluso más duplicaciones de población.
En consecuencia, en algunas realizaciones, los métodos de tratamiento instantáneos aumentan el número de duplicaciones de la población en al menos una, dos, cuatro o incluso más duplicaciones de la población. En algunas realizaciones, los métodos de tratamiento aumentan el número de duplicaciones de la población en al menos 5, 10, 15, 20 o incluso más duplicaciones de la población.
En algunas de las realizaciones del método instantáneo, los compuestos o composiciones de la invención se administran a la célula animal mediante electroporación. En realizaciones específicas, un compuesto de la invención se administra a la célula animal mediante electroporación en ausencia de un vehículo de administración. En otras realizaciones específicas, un compuesto de la invención y un componente de ARN de telomerasa se administran a la célula animal mediante electroporación.
kits
En otro aspecto, la presente descripción proporciona kits listos para usar para usar en la extensión de telómeros en una célula de mamífero. Los kits comprenden cualquiera de los compuestos o composiciones descritos anteriormente, junto con las instrucciones para su uso. En algunas realizaciones, los kits comprenden además materiales de embalaje. En realizaciones preferidas, los materiales de envasado son herméticos al aire. En estas realizaciones, los materiales de envasado pueden llenarse opcionalmente con un gas inerte, como, por ejemplo, nitrógeno, argón o similar. En algunas realizaciones, los materiales de envasado comprenden un recipiente de lámina metálica, como, por ejemplo, una bolsa de aluminio sellada o similar. Dichos materiales de envasado son bien conocidos por los expertos en la materia.
En algunas realizaciones, el kit puede comprender además un desecante, un medio de cultivo, un inhibidor de RNasa u otros componentes similares. En algunas realizaciones, el kit puede comprender además una combinación de más de uno de estos componentes adicionales. En algunas realizaciones de kits, la composición del kit es estéril.
Otros aspectos
En otro aspecto más, la invención proporciona nuevos compuestos, composiciones, kits y métodos de acuerdo con los siguientes párrafos numerados:
1. Una composición para la extensión de los telómeros que comprende:
un ácido ribonucleico que comprende al menos un nucleósido modificado y codifica una transcriptasa inversa de telomerasa; y
un vehículo de suministro para el ácido ribonucleico;
donde los telómeros se extienden dentro de una célula tratada con la composición.
2. La composición del párrafo 1, en la que la transcriptasa inversa de telomerasa es una transcriptasa inversa de telomerasa de mamíferos, aves, reptiles o peces o una variante que conserva la actividad catalítica de la telomerasa.
3. La composición del párrafo 2, en la que la transcriptasa inversa de telomerasa es una transcriptasa inversa de telomerasa humana.
4. La composición del párrafo 1, en la que el ácido ribonucleico comprende una caperuza en 5', una región no traducida en 5', una región no traducida en 3' y una cola poli-A.
5. La composición del párrafo 4, en la que la cola poli-A aumenta la estabilidad del ácido ribonucleico.
6. La composición del párrafo 4, en la que la región no traducida 5' o la región no traducida 3' comprenden una secuencia de un ARNm estable o un ARNm que se traduce eficientemente.
7. La composición del párrafo 4, en la que la región no traducida 5' y la región no traducida 3' comprenden ambas una secuencia de un ARNm estable o un ARNm que se traduce eficientemente.
8. La composición del párrafo 4, en la que la tapa 5', la región 5' no traducida o la región 3' no traducida estabiliza el ácido ribonucleico, aumenta la tasa de traducción del ácido ribonucleico o reduce la inmunogenicidad del ácido ribonucleico.
9. La composición del párrafo 1, en la que el al menos un nucleósido modificado reduce la inmunogenicidad del ácido ribonucleico.
10. La composición del párrafo 1, en la que el ácido ribonucleico es un ácido ribonucleico sintético.
11. La composición del párrafo 10, en la que el ácido ribonucleico sintético es un ácido ribonucleico sintético purificado.
12. La composición del párrafo 11, en la que el ácido ribonucleico sintético se purifica para eliminar los componentes inmunogénicos.
13. La composición del párrafo 1, en la que el ácido ribonucleico codifica para una transcriptasa inversa de telomerasa humana, de gato, de perro, de ratón, de vaca, de oveja, de cerdo, de elefante africano, de pollo, de rata, de pez cebra, de medaka japonés o de chimpancé, o un polipéptido con al menos un 95% de identidad de secuencia con la transcriptasa inversa de la telomerasa.
14. La composición del párrafo 1, en la que la composición comprende además un componente de ARN de telomerasa.
15. La composición del párrafo 14, en la que el componente de ARN de telomerasa es un componente de ARN de telomerasa de mamífero, ave, reptil o pez.
16. La composición del párrafo 15, en la que el componente de ARN de telomerasa es un componente de ARN de telomerasa humana.
17. La composición del párrafo 1, en la que el vehículo de administración es un exosoma, una nanopartícula lipídica, una nanopartícula polimérica, una partícula de lipoproteína natural o artificial, un lípido catiónico, una proteína, un complejo proteína-ácido nucleico, un liposoma, un virosoma , o un polímero.
18. La composición del párrafo 17, en la que el vehículo de administración es un lípido catiónico.
19. La composición del párrafo 1, en la que el vehículo de administración no es inmunogénico.
20. Un método para extender los telómeros, que comprende el paso de:
administrar la composición de cualquiera de los párrafos 1 a 19 a una célula animal, donde al menos un telómero se extiende dentro de la célula.
21. El método del párrafo 20, en el que la célula tiene al menos un telómero acortado antes del paso de administración.
22. El método del párrafo 20, en el que la célula es de un sujeto que padece o está en riesgo de padecer una enfermedad relacionada con la edad, una afección relacionada con la edad o una disminución de la función o apariencia relacionada con la edad.
23. El método del párrafo 20, en el que la célula proviene de un sujeto que padece o está en riesgo de cáncer, enfermedad cardíaca, accidente cerebrovascular, diabetes, enfermedad de Alzheimer, osteoporosis, disminución de la capacidad física o apariencia, trauma físico o estrés físico crónico, o trauma psicológico o estrés psicológico crónico.
24. El método del párrafo 20, en el que la célula es una célula somática de linaje endodérmico, mesodérmico o ectodérmico, o una línea germinal o una célula embrionaria.
25. El método del párrafo 20, en el que la célula es una célula madre pluripotente inducida o una célula utilizada para producir una célula madre pluripotente inducida.
26. El método del párrafo 20, en el que la célula es una célula transdiferenciada o una célula utilizada para producir una célula transdiferenciada.
27. El método del párrafo 20, en el que la célula es una célula aislada y el paso de administración no dura más de 48 horas.
28. El método del párrafo 20, en el que la célula es una célula aislada y el paso de administración se realiza no más de cuatro veces.
29. El método del párrafo 20, en el que la célula es una célula aislada, y el método comprende además la etapa de medir la actividad de la telomerasa en la célula.
30. El método del párrafo 29, en el que el paso de administración aumenta la actividad de la telomerasa en la célula.
31. El método del párrafo 30, en el que la actividad de la telomerasa se incrementa transitoriamente en al menos un 5%.
32. El método del párrafo 30, en el que la vida media de actividad de telomerasa aumentada no dura más de 48 horas.
33. El método del párrafo 20, en el que la célula es una célula aislada, y el método comprende además la etapa de medir la longitud media de los telómeros en la célula.
34. El método del párrafo 33, en el que la longitud media de los telómeros se incrementa en al menos 0,1 kb.
35. El método del párrafo 20, en el que la celda es una celda aislada, y el método comprende además el paso de medir la capacidad de duplicación de la población en la celda.
36. El método del párrafo 35, en el que la capacidad de duplicación de la población aumenta en al menos un 25%.
37. El método del párrafo 20, en el que la célula es de un sujeto mamífero.
38. El método del párrafo 37, en el que la célula es de un sujeto humano.
39. El método del párrafo 20, en el que la célula es una célula aislada.
40. El método del párrafo 20, en el que la célula no es una célula aislada.
41. Un kit para extender los telómeros en una célula animal, que comprende:
la composición de cualquiera de los párrafos 1 a 19; y
instrucciones para usar la composición para extender los telómeros.
42. El kit del párrafo 41, que comprende además materiales de embalaje.
43. El kit del párrafo 42, donde los materiales de empaque son herméticos.
44. El kit del párrafo 42, en el que los materiales de embalaje comprenden un recipiente de lámina metálica.
45. El kit del párrafo 41, que comprende además un desecante.
46. El kit del párrafo 41, que comprende además un medio de cultivo.
47. El kit del párrafo 41, que además comprende un inhibidor de RNasa.
48. El kit del párrafo 41, en el que la composición es estéril.
Será evidente para un experto en las técnicas pertinentes que se pueden realizar otras modificaciones y adaptaciones adecuadas a los compuestos, composiciones, métodos y kits descritos en este documento sin apartarse del alcance de la invención o cualquier realización de la misma. Habiendo descrito ahora la presente invención en detalle, la misma se entenderá más claramente con referencia a los siguientes ejemplos, que se incluyen en este documento con fines ilustrativos únicamente y no pretenden ser limitativos de la invención.
EJEMPLOSEjemplo 1. Extensión de telómeros altamente eficiente en células humanas usando ARNm modificado que codifica telomerasaLas enfermedades del mantenimiento inadecuado de la longitud de los telómeros y la necesidad de una mayor capacidad de replicación celular para las terapias celulares y las aplicaciones de bioingeniería motivan el desarrollo de métodos seguros para la extensión de los telómeros. Blackburn et al. (2010) Cancer Prev Res ( Filadelfia) 3: 394-402 ; Calado et al. (2012) Leucemia 26:700-707; Alter et al. (2009) Sangre 113:6549-6557; Mohsin et al. (2012) Revista del Colegio Americano de Cardiologíadoi:10.1016/j.jacc.2012.04.047. El suministro de ARNm para aumentar transitoriamente la cantidad de proteína codificada por el ARNm para aplicaciones terapéuticas se facilita mediante la incorporación de nucleósidos modificados que reducen la inmunogenicidad y aumentan la estabilidad. Karikó et al. (2005) Inmunidad 23:165-175; Karikó et al. (2011) Res. de ácidos nucleicos. 39:e142; doi: 10.1093/nar/gkr695.
Para ser terapéuticamente útil, un tratamiento de extensión de telómeros idealmente debería ser no inmunogénico; específico; capaz de iniciarse antes de que los telómeros se acorten a longitudes críticamente cortas que causan inestabilidad cromosómica y mayor riesgo de cáncer (Wentzensen et al. (2011) Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev. 20:1238-1250; Calado et al. (2012) Leukemia 26: 700-707, Artandi y DePinho (2010) Carcinogénesis31:9-18); transitorio e intermitente, para permitir que el mecanismo normal de acortamiento de los telómeros contra el cáncer funcione casi continuamente; eficaz incluso en células de división lenta, como algunas poblaciones de células madre y progenitoras; entregable in vitro e in vivo utilizando vehículos no inmunogénicos; y, finito, permitir solo suficientes divisiones celulares adicionales para mejorar o prevenir potencialmente enfermedades de mantenimiento inadecuado de los telómeros, o para permitir la amplificación suficiente de células para terapias celulares o aplicaciones de bioingeniería. Los tratamientos existentes, incluidos los tratamientos que utilizan moléculas pequeñas, no cumplen todos estos criterios. Harley et al. (2011) Rejuvenecimiento Res.14:45-56. La entrega viral de TERT, aunque posiblemente inducible, corre el riesgo de mutagénesis por inserción y, por lo tanto, presenta serios problemas de seguridad. Los tratamientos que involucran la sobreexpresión continua de telomerasa son potencialmente inseguros, porque en una célula con una mutación oncogénica, ya sea debido a telómeros críticamente cortos y la inestabilidad cromosómica resultante (O'Sullivan y Karlseder (2010) Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 11: 171- 181) u otra causa, la expresión constitutiva de telomerasa, ya sea debido a una segunda mutación o a un fármaco, puede respaldar la malignidad al permitir una proliferación ilimitada. Artandi y DePinho (2010) Carcinogénesis 31:9-18; Ding et al. (2012) Celda 148:896-907.
Los criterios para la extensión segura de los telómeros se cumplen mediante un enfoque basado en el ARN, facilitado por el descubrimiento reciente de que ciertos nucleósidos naturales que se encuentran en el ARN aumentan la estabilidad y reducen la inmunogenicidad del ARN exógeno cuando se administran a las células. Karikó et al. (2005) Inmunidad23:165-175. En la Tabla 4 se enumeran ejemplos de dichos nucleósidos. Sin pretender ceñirse a la teoría, estas versiones modificadas de nucleósidos canónicos pueden permitir que los receptores tipo Toll del sistema inmunitario innato distingan el ARN mod endógeno del ARN extraño que no contiene estos nucleótidos. La entrega de modRNA sintético suficientemente purificado que contiene estos nucleósidos no canónicos a las células da como resultado una mayor estabilidad del modRNA y una elevación transitoria de la proteína codificada por el modRNA con una respuesta inmunitaria reducida o anulada. Karikó et al. (2011) Res. de ácidos nucleicos.39:e142; doi: 10.1093/nar/gkr695. Por lo tanto, la entrega de modRNA exógeno presenta oportunidades sin precedentes para aplicaciones que requieren una producción transitoria de proteínas. Por ejemplo, se ha transfectado modRNA biomimético en fibroblastos, reprogramándolos así en células madre pluripotentes. Yakubov et al. (2010) Bioquímica. Biografía. Res. común 394:189-193. También se inyectó modRNA biomimético en ratones para rescatar un modelo de deficiencia de proteína de surfactante pulmonar y para elevar los niveles de eritropoyetina y hematocrito. Kormann et al. (2011) Nacional. Biotecnología.29:154-157. Como se describió anteriormente, los nucleósidos usados en los ARN mod usados en el presente documento se eligieron no solo para aumentar la estabilidad sino también para reducir o anular la inmunogenicidad y para aumentar la eficiencia de traducción del ARN. La transfección de células dendríticas usando un ARNm no modificado que codifica hTERT, mientras que resultó en un aumento en la actividad de la telomerasa dentro de las células, también provocó una fuerte respuesta de linfocitos T citotóxicos específicos de hTERT. Saeboe-Larssen et al. (2002) Revista de métodos inmunológicos 259: 191-203. Por lo tanto, es probable que los enfoques que utilizan ARN no modificados no sean efectivos para extender los telómeros en las células.
Por lo tanto, la entrega de modRNA que codifica TERT a las células puede usarse para aumentar transitoriamente los niveles de proteína TERT y la actividad de la telomerasa lo suficiente como para extender los telómeros y aumentar la capacidad replicativa en una cantidad finita. El aumento de los niveles de actividad de la telomerasa se produce lo suficientemente rápido como para permitir un tratamiento de extensión de los telómeros que es breve y poco frecuente (verHIGO. 1AyHIGO. 3).
Para demostrar el enfoque, se sintetizó modRNA de TERT utilizando proporciones de nucleósidos canónicos y no canónicos que confieren estabilidad, traducción eficiente e inmunogenicidad reducida o anulada. Yakubov et al. (2010) Bioquímica. Biografía. Res. común 394:189-193; Karikó et al. (2011) Res. de ácidos nucleicos. 39:e142; doi: 10.1093/nar/gkr695. El modRNA sintético contiene las UTR 5′ y 3′ del mRNA de beta globina, que tiene una vida media relativamente larga. Para mejorar aún más la estabilidad, el modRNA tiene una cola poli-A larga de 151 nucleótidos. Para maximizar la fidelidad de la plantilla de ADN de TERT larga utilizada en la reacción de transcripción in vitro para generar ARN, las plantillas de ADN se generaron utilizando un enfoque basado en plásmidos en lugar de PCR.
Para distinguir la extensión de telómeros de buena fe de la selección de células con telómeros largos de una población inicial heterogénea, se sintetizó un modRNA de control que codifica una forma catalíticamente inactiva de TERT (CI TERT) con la mutación de un solo residuo D712A, en la que una de las tríadas de Los aspartatos que coordinan metales en el sitio catalítico del dominio de la transcriptasa inversa se sustituyen con alanina, anulando la actividad catalítica de CI TERT pero dejándolo estructuralmente intacto hasta el punto de poder unirse al ADN molde y tan estable como TERT en lisado de reticulocitos. Wyatt (2009) "Análisis de estructura-función de la transcriptasa inversa de la telomerasa humana" Universidad de Calgary, Ph.D. Tesis (http://dspace.ucalgary.ca/bitstream/1880/47511/1/2009_Wyatt_PhD.pdf).
Los fibroblastos pulmonares fetales humanos MRC-5 se eligieron como células de prueba en este ejemplo porque estas y otras cepas de fibroblastos humanos han servido durante décadas como caballos de batalla en el campo de los telómeros y, por lo tanto, hay abundantes datos para informar el diseño y el análisis experimental. Las células MRC-5 también tienen una actividad de telomerasa endógena relativamente baja y muestran un acortamiento de los telómeros y una eventual senescencia. Dado que el estrés oxidativo aumenta la tasa de acortamiento de los telómeros en las células MRC-5 (von Zglinicki et al. (2000) Free Radic. Biol. Med. 28:64-74), y hace que TERT se localice en el citoplasma donde no puede extender los telómeros (Ahmed et al. (2008) J. Cell. Sci.121:1046-1053), las células se cultivaron en oxígeno al 5% en lugar del ambiente. Para aumentar aún más la probabilidad de éxito, las células también se cultivaron en un medio optimizado para la producción de proteínas en células MRC-5 (Wu et al. (2005) Cytotechnology 49:95-107).
La eficiencia de la extensión de telómeros basada en modRNA está sujeta a varios factores, incluida la eficiencia de transfección, traducción y plegamiento en telomerasa funcional, y la capacidad de escapar, al menos transitoriamente, de los extensos mecanismos de regulación postraduccional que inhiben TERT y telomerasa en muchas células. tipos que incluyen células MRC-5. Mientras que las eficiencias de transfección con especies de ARN mod más pequeñas como nGFP (0,8 kb) en células MRC-5 suelen ser superiores al 90 %, incluso con concentraciones bajas de ARN mod (FIGURAS. 6A-6C), el marco de lectura abierto de TERT es relativamente grande (3399 pb), y la construcción TERT de ARN mod incluye UTR y una cola poli-A, lo que hace que la construcción sea aún más grande (3751 pb). Como se muestra enHIGO. 1B, sin embargo, tanto TERT como CI TERT se transfectaron eficientemente en células MRC-5 mediante lípidos catiónicos (según lo medido por RT-PCR de ARNm recolectado al final del tratamiento de células MRC-5 tratadas con 1 ug/ml de TERT modRNA durante 5 horas) . Además, la administración de TERT o CI TERT modRNA resultó en aumentos equivalentes y significativos (P<0.03 y <0.01, respectivamente) en la cantidad de proteína reconocida por el anticuerpo anti-TERT, con un tamaño de aproximadamente 122 kDa, cercano al tamaño estimado. de TERT de 127 kDa (HIGO. 1C). Mecha et al. (1999) Gen 232:97-106. Los niveles de proteína se midieron mediante Western blot de fluorescencia infrarroja cuantitativa. Los niveles de proteína TERT no difieren significativamente entre las células tratadas con TERT y las células tratadas con CI TERT (n=3).
Para formar telomerasa funcional, TERT debe plegarse correctamente y formar un complejo con al menos TERC. La telomerasa también está fuertemente regulada postraduccionalmente, incluso por localización citoplasmática y fosforilación inhibidora. Cifuentes-Rojas y Shippen (2012) Mutat. Res. 730:20-27; doi:10.1016/j.mrfmmm.2011.10.003. De hecho, no todas las células que expresan TERT pueden mantener los telómeros. Contador et al. (1998) Proceso. nacional Academia ciencia Estados Unidos 95:14723-14728. La administración de modRNA TERT aumentó la actividad de la telomerasa de manera dependiente de la dosis hasta un máximo a una concentración de aproximadamente 0,6 ug/ml (verHIGO. 7), y se utilizó una concentración de 1 ug/ml para experimentos posteriores. Los niveles de actividad de la telomerasa aumentaron rápidamente, pero volvieron a los niveles iniciales en aproximadamente 48 horas, y el ARN mod de CI TERT no provocó ningún cambio en la actividad de la telomerasa (HIGO. 1D). La actividad de la telomerasa se midió mediante el ensayo TRAPeze® RT basado en qPCR (n=3).
Dado que la regulación postraduccional de TERT está mediada en parte por el secuestro citoplasmático de una manera dependiente del ciclo celular, también se investigó la localización subcelular de TERT en células tratadas y no tratadas. Cifuentes-Rojas et al. (2011) Mutat. Res . doi:10.1016/j.mrfmmm.2011.10.003. En consonancia con los resultados de la transferencia Western, la inmunocitoquímica mostró una proteína abundante, aunque posiblemente inhibida, reconocida por el anticuerpo TERT en células MRC-5 no tratadas, lo que dificulta distinguir el TERT endógeno del exógeno (datos no mostrados).
Se usaron células dentro de aproximadamente 10 duplicaciones de población (PD) desde el inicio de la senescencia replicativa para medir el efecto del tratamiento con modRNA TERT en la longitud de los telómeros y la capacidad replicativa. La decisión de usar tales celdas se basó en al menos dos factores. Primero, las células en esta etapa tienen telómeros relativamente cortos, y dado que la telomerasa extiende preferentemente los telómeros cortos, incluso en las células MRC-5, el tratamiento de las células en esta etapa debería dar como resultado un efecto mayor y más fácil de medir. Britt-Compton et al. (2009) FEBRERO Lett.583:3076-3080. En segundo lugar, al tratar las células en esta etapa, se reduce la cantidad de tiempo requerida para determinar si el tratamiento aumentó la capacidad replicativa. En las condiciones actuales, la senescencia replicativa comienza aproximadamente 50 PD después de recibir las células MRC-5 del proveedor (consulte Métodos para obtener detalles) y, por lo tanto, se decidió tratar las células en aproximadamente 40 PD. Las células MRC-5 en esta etapa tienen un promedio longitudes de telómeros de aproximadamente 5-7 kb, según el historial de cultivo y la PD al recibirlos de los proveedores. Sitte et al. (1998) Radic Libre. Biol. Medicina. 24:885-893; Mackenzie et al. (2000) Exp. Resolución celular 259:336-350.
Se tuvieron en cuenta varias consideraciones al diseñar el programa de tratamiento (HIGO. 4A). Las tasas de extensión de los telómeros obtenidas utilizando la transducción viral de TERT en células MRC-5 varían, pero son del orden de aproximadamente 0,2 kb por división. Mackenzie et al. (2000) Exp. Resolución celular 259:336-350. Las tasas de acortamiento de los telómeros en las células MRC-5 varían con las condiciones y prácticas de cultivo (Sitte et al. (1998) Free Radic. Biol. Med. 24:885-893; von Zglinicki et al. (2000) Free Radic. Biol. Med. . 28:64-74), pero son de aproximadamente 0,1 kb por PD en oxígeno ambiental (Sitte et al. (1998) Free Radic. Biol. Med. 24:885-893). Las células se cultivaron en oxígeno al 5%, ya que los telómeros de las células MRC-5 se acortan más lentamente en condiciones menos oxidativas. von Zglinicki et al. (2000) Radic Libre. Biol. Medicina.28:64-74. Se encontró que el tiempo de PD en células PD 40 MRC-5 era de aproximadamente 33 horas. Teniendo en cuenta estos datos, se podría esperar que se requieran múltiples tratamientos para detectar la extensión de los telómeros dentro de la resolución de los métodos elegidos de medición de la longitud de los telómeros, análisis de fragmentos de restricción de los telómeros (TRF) e hibridación in situ con fluorescencia cuantitativa (Q-FISH) . Se eligió que el intervalo entre tratamientos fuera de 48 horas ya que se encontró que los niveles de actividad de la telomerasa volvieron a los niveles de referencia en este momento después de un único tratamiento.
Como se muestra enFIGURAS. 3B-3D, el tratamiento de células MRC-5 con hTERT modRNA da como resultado un aumento significativo en la longitud de los telómeros en estas células en comparación con las células que no se tratan o que se tratan solo con el vehículo de administración. Las micrografías de fluorescencia de las células MRC-5 en metafase después del tratamiento muestran la ubicación de una sonda de telómero en los cromosomas de estas células (HIGO. 4E).
El efecto del tratamiento sobre la longitud de los telómeros también se midió mediante hibridación in situ con fluorescencia cuantitativa (Q-FISH) (HIGO. 4F), porque esta técnica proporciona una resolución relativamente alta (0,3 kb) y porque la fluorescencia de las sondas de telómero Q-FISH es directamente proporcional a la longitud del telómero. Lansdorp et al. (1996) Hum. mol. Gineta. 5:685-691; Martens et al. (1998) Nacional. Gineta. 18:76-80. Debido a que la capacidad replicativa es el parámetro funcional de mayor interés en el aumento como resultado de la extensión de los telómeros, se construyó una curva estándar que relaciona el número de duplicación de la población de células MRC-5 con la longitud de los telómeros medida con Q-FISH (HIGO. 4G(i)). Después de tres tratamientos de PD 40 MRC-5 con ARNm de TERT a intervalos de 48 horas, la longitud total promedio de los telómeros por célula aumentó en un 56+/-5 % (n=15 células para cada una de las dos réplicas biológicas para cada tratamiento; las barras de error representan sem ). Las longitudes de los telómeros en las células PD 40 tratadas fueron similares a las de las células PD 3 no tratadas (HIGO. 4G(ii)) (línea discontinua superior) y, por tanto, el tratamiento amplió los telómeros en la cantidad en la que los telómeros se acortan en estas células durante 37 PD. En este número de PD en condiciones de cultivo estándar, los telómeros MRC-5 se acortan en más de >1 kb. Sitte et al. (1998) Radic Libre. Biol. Medicina. 24:885-893. De acuerdo con esto, el aumento observado en la longitud de los telómeros del 56% corresponde a un aumento en la longitud promedio de los telómeros de aproximadamente 0.6-2.5 kb, basado en el hecho de que las células PD 40 MRC-5 tienen longitudes de telómero promedio de aproximadamente 5-7 kb como medido usando TRF (Sitte et al. (1998) Free Radic. Biol. Med. 24:885-893; MacKenzie et al. (2000) Exp. Cell Res.259:336-350), que sobrestima la longitud de los telómeros en aproximadamente 2,5-4 kb y, por tanto, las longitudes medias reales de los telómeros en las células PD 40 MRC-5 están en el intervalo de 1-4,5 kb. Auber et al. (2012) Mutat. Res. 730:59-67. Dado que el tratamiento duró un total de 144 horas, y el tiempo de duplicación de la población de las células fue de aproximadamente 33 h. durante este tiempo, las células sufrieron aproximadamente 4-5 PD. Por lo tanto, la tasa de extensión de los telómeros fue de aproximadamente 0,1-0,6 kb por PD, cuyo rango superior se acerca a las tasas máximas jamás informadas después de la transducción viral de ADN que codifica TERT, y cuyo rango inferior es comparable a las tasas típicas observadas con la administración viral. . Como era de esperar, las células no tratadas tienen longitudes de telómero equivalentes a las células PD 40 durante la generación de la curva estándar (línea discontinua inferior enHIGO. 4G).
A continuación, se examinó el efecto del tratamiento con ARNm de TERT sobre la capacidad de replicación celular. Como se esperaba, las células no tratadas y las tratadas solo con vehículo envejecieron dentro del rango normal de 50-60 PD (HIGO. 5A). En contraste sorprendente, las células tratadas con ARNm de TERT continuaron proliferando más allá de la PD en la que las poblaciones de control alcanzaron la senescencia replicativa de una manera dependiente de la dosis, y cada tratamiento adicional confirió significativamente más PD adicional.
Tres tratamientos con ARNm de TERT dieron como resultado un aumento en la capacidad replicativa de 28+/-1,5 PD. Este resultado es consistente con una estimación de que los telómeros se extendieron en >1 kb, ya que los telómeros MRC-5 se acortan aproximadamente 0,1 kb por PD (Sitte et al. (1998) Free Radic. Biol. Med. 24:885-893) en oxígeno ambiental (20%), y las células tratadas se cultivaron en oxígeno al 5%, en el que los telómeros se acortan más lentamente. El aumento observado en la capacidad replicativa de las células tratadas de 28 PD es equivalente a la pérdida de capacidad replicativa que se produce en los fibroblastos normales durante más de una década de envejecimiento humano normal. Takubo et al. (2010) Geriatr Gerontol Internacional. 10 Suplemento 1:S197-206; doi: 10.1111/j.1447-0594.2010.00605.x.; Allsopp, RC et al. (1992) Proceso. nacional Academia ciencia EE.UU89:10114-10118.
Es importante destacar que para las aplicaciones terapéuticas, todas las células tratadas estudiadas hasta la fecha finalmente envejecieron y, de hecho, envejecieron en menos PD que las células no tratadas con longitudes de telómero equivalentes, como era de esperar, ya que las células tratadas han sufrido docenas de PD adicionales, en comparación con las células no tratadas. con telómeros de longitud similar, en los que acumular daños en el ADN no telomérico u otros daños que podrían afectar las tasas de acortamiento de los telómeros o apoyar de otro modo la inducción de la senescencia replicativa.
A medida que las células MRC-5 se acercaban y entraban en la senescencia replicativa, tendían a hincharse varias veces el diámetro de los primeros pasajes (HIGO. 8A). Al igual que con la senescencia replicativa, esta transición se retrasó en las células tratadas con modRNA TERT, pero no en las células que recibieron modRNA CI TERT o vehículo solamente (HIGO. 8B).
De acuerdo con el hallazgo de que CI TERT modRNA no provocó un aumento en la actividad de la telomerasa (HIGO. 1D), el tratamiento con CI TERT modRNA no cambió la distribución de la longitud de los telómeros en relación con las células no tratadas, y CI TERT modRNA tampoco aumentó la capacidad replicativa, a pesar de causar un aumento en el nivel de proteína TERT equivalente al causado por TERT modRNA (HIGO. 1C). Dado que la única diferencia entre TERT y CI TERT es una sustitución de un solo residuo que anula la capacidad de CI TERT para transferir nucleótidos a los telómeros, estos resultados respaldan firmemente la hipótesis de que el aumento en la longitud de los telómeros y la capacidad replicativa observados en las células tratadas con TERT modRNA se debe a la extensión de los telómeros de buena fe en al menos algunas de las células tratadas, más que a la selección de una subpoblación preexistente de células con telómeros más largos.
Los resultados de este ejemplo muestran que la administración de modRNA de TERT a células humanas eleva transitoriamente la actividad de la telomerasa, extiende rápidamente los telómeros y aumenta la capacidad de replicación en una cantidad finita y, por lo tanto, potencialmente segura. El modRNA biomimético purificado también es hipoinmunogénico. Karikó et al. (2011) Res. de ácidos nucleicos. 39:e142; doi: 10.1093/nar/gkr695. Por lo tanto, la entrega de modRNA cumple con varios criterios importantes para un tratamiento de extensión de telómeros terapéuticos, y también es prometedor con respecto a otros criterios que incluyen especificidad, entrega dirigida y capacidad para superar la regulación postraduccional. En cuanto a la especificidad, la sobreexpresión de TERT también puede afectar a otros genes como Wnt (Park et al. (2009) Nature460:66-72), pero dichos efectos pueden evitarse mediante la administración de ARNmod que codifica un TERT mutado en los sitios de unión de factores que median tales efectos no específicos. Con respecto a la entrega, el descubrimiento reciente de que en humanos el modRNA se transporta en exosomas entre células a través de la sangre y otros fluidos corporales permite la entrega de modRNA basada en exosomas para la extensión de los telómeros y otras aplicaciones. Lakhal y Wood (2011) Bioensayos33:737-741. Los exosomas se han utilizado con éxito para administrar modRNA biomimético a las células in vitro (datos no mostrados). Con respecto a la regulación postraduccional, la regulación postraduccional inhibitoria independiente y dependiente del ciclo celular de TERT puede evitarse mediante la administración de ARN mod que codifica TERT mutado en uno o más sitios conocidos que median esas actividades, como la secuencia de exportación nuclear, o mediante la co- entregando modRNA que codifica otros miembros de la telomerasa o complejos de telómeros. Estos enfoques permiten la extensión de los telómeros incluso en células que se dividen lentamente o que no se dividen, lo que hace que el tratamiento con ARNmod TERT sea apropiado para poblaciones de células madre y progenitoras inactivas o de división lenta. Por lo tanto, la extensión de telómeros basada en modRNA encuentra un uso inmediato para aumentar la capacidad replicativa de las células para la investigación y, además, para las terapias celulares.
En resumen, el modRNA que codifica la transcriptasa inversa de la telomerasa humana (TERT) se administró a fibroblastos de pulmón humano MRC-5 tres veces durante 96 horas. Los telómeros en las células tratadas se extendieron en >1 kb, una cantidad en la que los telómeros de fibroblastos se acortan durante más de una década de envejecimiento en humanos en promedio. Takubo et al. (2010) Geriatr Gerontol Internacional.10 Suplemento 1:S197-206; doi: 10.1111/j.1447-0594.2010.00605.x. La actividad de la telomerasa volvió a los niveles previos al tratamiento dentro de las 48 horas y el inicio de la senescencia replicativa en las células tratadas se retrasó aproximadamente 30 veces la población, de manera dependiente de la dosis. Por lo tanto, la entrega de ARN de telomerasa que contiene nucleósidos modificados a las células permite la rápida e hipoinmunogénica o no inmunogénica y el ARN es un enfoque útil para la extensión de los telómeros para diversas aplicaciones.
Métodos
Síntesis y generación de plantillas de modRNA.
El marco de lectura abierto (ORF) de TERT humano de tipo salvaje (WT) utilizado para generar las plantillas de ADN para la síntesis de modRNA es idéntico a la secuencia de referencia NM_198253.2 de la variante 1 del transcrito de TERT humano del NCBI, y se generó al realizar la modificación G516D en el ORF del plásmido pBABE-neo-hTERT (Addgene plásmido 1774). El residuo 516 está en el motivo QFP de la extensión N-terminal de TERT, un motivo asociado con la multimerización y la unión al ARN de TERT. El mutante TERT catalíticamente inactivo (CI TERT) se generó a partir de la secuencia WT TERT introduciendo la mutación D712A. Los ORF de WT y CI, TERT se insertaron en el MCS de un plásmido de partida que contenía el promotor T7, el 5′ UTR de la beta globina humana (hBB), el MCS, el 3′ UTR de hBB, una secuencia poli-A de 151 pb , y un sitio de restricción para la linealización con la enzima de clase II siguiendo la secuencia poli-A. El plásmido intermedio resultante se secuenció al menos por cuadruplicado para garantizar la fidelidad, se linealizó y se transcribió a ARN protegido utilizando la polimerasa de ARN del kit MEGAscript T7 (Ambion, Austin, Texas) y una mezcla de nucleótidos personalizada de nucleótidos canónicos y no canónicos. (TriLink BioTechnologies) en el que las concentraciones finales de nucleótidos por 40 ul de reacción IVT fueron de 7,5 mM para cada adenosina-5′-trifosfato (ATP), 5-metilcitidina-5′-trifosfato (m5C) y pseudouridina-5′-trifosfato (Ψ), 1,5 mM para guanosina-5′-trifosfato (GTP) y 6 mM para el análogo cap (ARCA, NEB), o una relación molar de ATP:m5C:Ψ:GTP:ARCA de 1:1:1 :0.2:0.8. Para disminuir aún más la inmunogenicidad potencial del ARNm relacionado con la fracción portadora de 5'-3P (~20 % del total), los productos IVT se trataron con fosfatasa (fosfatasa antártica, NEB). El tamaño y la integridad de los productos modRNA se verificaron mediante electroforesis en gel de agarosa desnaturalizante.
Células y Cultivo Celular.
Los fibroblastos pulmonares fetales humanos MRC-5 (ATCC CCL-171) se recibieron de ATCC en el pasaje 14, el número de pasaje actual de su inventario de distribución. Dado que la ATCC no indica el número de PD, los valores de PD citados aquí se refieren al número de PD después de recibir las células de la ATCC, definido aquí como PD 0. Para acortar sus telómeros en preparación para los experimentos de extensión de telómeros, las células se cultivaron siguiendo las pautas de la ATCC. en DMEM con 10% FBS, en oxígeno ambiente y 5% CO 2 . El tratamiento de extensión de telómeros comenzó aproximadamente a los 40 PD después de recibir las células de la ATCC. Al menos 48 horas antes del comienzo del tratamiento con modRNA, las células se transfirieron a medio de oxígeno al 5 % y DMEM que contenía FBS al 20 % y penicilina-estreptomicina. Las células se trataron al menos 24 horas después de la siembra y 24 horas antes de la tripsinización.
Transfección de modRNA.
Las células se transfectaron con modRNA TERT 0,4 nM y TERC RNA 2,0 nM, a menos que se especifique lo contrario, usando Lipofectamine RNAiMax (Invitrogen), un lípido catiónico, en medio de suero reducido Opti-MEM (Invitrogen) durante 4-5 horas, después de lo cual se volvieron a colocar en medio normal.
Medición de la actividad de la telomerasa.
24 horas después del comienzo del período de transfección, las células se lavaron con PBS, se tripsinizaron y se sedimentaron a 500 g durante 5 min. y se lavaron con PBS, se repeleron y luego se lisaron siguiendo las instrucciones del kit TRAPeze RT (Millipore). Los pasos de transcripción inversa y qPCR se llevaron a cabo en un Roche LightCycler 480 II y un ABI 7900 HT. La actividad de la telomerasa de las muestras siempre se comparó con el estándar de referencia provisto con el kit, ya que descubrimos que el aumento de veces era propenso a ser muy variable, probablemente debido a la baja actividad de la telomerasa en las células MRC-5.
Inmunocitoquímica.
24 horas después del inicio del período de transfección, las células se lavaron con PBS, se fijaron en paraformaldehído al 2 % durante 20 minutos, se lavaron tres veces con PBS, se bloquearon en PBS que contenía BSA al 7,5 % y Triton X-100 al 0,1 % durante 1 hora, se lavaron tres veces veces, se incubaron durante la noche a 4°C en un balancín en anticuerpo anti-TERT (ABCAM 32020 a 1:50 o Rockland 600-401-252S a 1:500) en PBS con 5% de BSA, se lavaron tres veces, se incubaron durante una hora en anticuerpo secundario, se lavó dos veces y luego dos veces más en un agitador durante 3 minutos cada vez, luego se incubó en 0,1 ug/ml de DAPI durante 3 minutos y se lavó cuatro veces en PBS.
Citometría de flujo.
Las células tratadas con 0,5-1,5 ug/ml de TERT modRNA y los controles se tripsinizaron 22 h. después del inicio de la transfección, lavado, fijado en paraformaldehído al 2 %, permeabilizado en BSA al 7,5 % con Triton X-100 al 0,1 % durante 20 min., lavado tres veces en PBS, bloqueado en BSA al 7,4 % durante 1 h, incubado en anti-TERT anticuerpo (ABCAM 32020 a 1:50) en PBS con BSA al 5 %, lavado tres veces, incubado en anticuerpo secundario (1:200) en PBS, luego lavado tres veces y resuspendido en tampón FACS y analizado en un citómetro de flujo Accuri C6 ( Becton Dickinson). La intensidad de fluorescencia media se calculó como la fluorescencia media de todas las células en las muestras tratadas y de control. Los datos se analizaron utilizando el software CFlow Plus.
RT-PCR
El ARN total se recolectó con el kit RNeasy Mini (Qiagen) y se convirtió en ADNc con el kit de ARN a ADNc de alta capacidad (Invitrogen). El ADNc se amplificó mediante PCR con los siguientes cebadores:
| hTERT-F: |
| (SEQ ID NO: 1) |
| 5′-GCCCTCAGACTTCAAGACCA |
|
| 3′-hBB-R: |
| (SEQ ID NO: 2) |
| 5′-AGGCAGAATCCAGATGCTCA |
|
| GAPDH-F: |
| (SEQ ID NÚM: 3) |
| 5′-GTGGACCTGACCTGCCGTCT |
|
| GAPDH-R: |
| (SEQ ID NO: 4) |
| 5′-GGAGGAGTGGGTGTCGCTGT |
Mancha occidental.
La proteína se recogió lavando las células una vez con PBS y luego lisando las células en tampón RIPA. La proteína se corrió en NuPAGE Novex Tris-Acetate Gels, se transfirió a una membrana de PVDF durante 2 h. a 35 V, luego se hibridó con anti-alfa tubulina (Sigma a 1:10 000) y anticuerpo anti-TERT (ABCAM 32020 a 1:1000 o Rockland 600-401-252S a 1:500) y anti-overnight a 4 °C La detección secundaria se realizó utilizando anticuerpos infrarrojos (680 nm y 800 nm) (LI-COR) y el generador de imágenes Odyssey (LI-COR). Las imágenes se analizaron utilizando ImageJ.
Q-PESCADO.
Las células se incubaron en 0,1 ug/ml de colcemida durante 4 horas antes de la fijación y preparación de extensiones en metafase siguiendo el procedimiento de Lansdorp et al. A continuación, se tiñeron 41 portaobjetos con el kit Telomere PNA FISH/FITC (Dako, Dinamarca), sustituyendo la sonda de telómero marcada con AlexaFluor 555 (Bio-Synthesis, EE. UU.) por la sonda del kit. Se tomaron imágenes de cada célula en un microscopio DeltaVision (Applied Precision, Inc., Washington) usando el software SoftWoRx usando un objetivo de aceite de 60x o 100x a intervalos de 0,2 micras en un rango de 3 micras usando una platina motorizada, y se usó un software personalizado identificar la imagen en la que cada punto de telómero estaba enfocado e integrar su intensidad en esa imagen enfocada. La variación temporal en la intensidad de la iluminación se compensó utilizando el fotosensor DeltaVision que registró la intensidad de la iluminación de cada imagen, y la variación en la intensidad espacial y la corriente oscura CCD y el error de lectura se compensaron mediante la adquisición de imágenes de campo plano e imágenes de campo oscuro, respectivamente. Al menos 15 células en metafase contribuyeron a cada réplica y cada muestra se midió al menos por duplicado en al menos dos experimentos separados.
Curvas de crecimiento.
Las células se recogieron y se contaron en un hemocitómetro, ya que un contador automático no pudo contar con precisión las células cuando la población se volvió heterogénea con respecto al diámetro cuando la población entró en senescencia replicativa. Se adquirieron imágenes para permitir la medición de los diámetros de las células. Los PD se calcularon como el log 2 de la proporción de números de células al final y al comienzo de cada período de cultivo entre pases.
Estadísticas.
El análisis estadístico se realizó utilizando Microsoft Excel. Las barras de error representan la media ± sem. Las longitudes de los telómeros se compararon mediante pruebas T con P<0,05 (dos colas) consideradas estadísticamente significativas.
Ejemplo 2. Efectos del tratamiento con ARNmod TERT en células endoteliales humanasLos efectos del tratamiento con TERT modRNA no se limitan a las células de fibroblastos. Como se muestra enHIGO. 9, las células endoteliales dérmicas microvasculares humanas ("HMDEC") muestran curvas de duplicación típicas, con un inicio temprano de la senescencia aproximadamente en el pasaje n.° 12 y con células completamente senescentes en el pasaje n.° 17. Como se muestra enHIGO. 10, el tratamiento de estas células en el pasaje n.º 18 con modRNA hTERT de tipo salvaje (barra derecha en cada serie) da como resultado la reversión de la senescencia, mientras que el tratamiento de control (barra izquierda en cada serie) o el tratamiento con modRNA hTERT mutante (barra central en cada serie) cada serie), no tuvo efecto sobre la senescencia celular.
HIGO. 11demuestra los efectos de diversos tratamientos sobre el crecimiento de HMDEC. Específicamente, las células tratadas tres veces con modRNA TERT de tipo salvaje (WT) entre el paso n.° 10 y el paso n.° 11 continuaron creciendo, mientras que las células no tratadas (UT), las células tratadas solo con portador (CO) y las células tratadas con un catalizador TERT inactivo (CI) dejó de duplicarse.
HIGO. 12muestra los resultados de la tinción con β-galactosidasa (bGAL) de HMDEC en el paso n.º 14 después del tratamiento con ARN mod WT y CI. Esta tinción mide la actividad de la β-galactosidasa a pH 6, que es una propiedad de las células senescentes que no se encuentra en las células presenescentes, inactivas o inmortales. Véase Dimri et al. (1995) Proceso. Academia Nacional. ciencia Estados Unidos 92:9363-7.
Métodos
La curva de duplicación de la población acumulada de HMDEC se construyó utilizando un formato de placa de 12 pocillos. Aproximadamente 10 5 de HMDEC se volvieron a sembrar en cada punto de tiempo por triplicado y el recuento de células se realizó el día 4 después del nuevo sembrado anterior. Como se muestra enHIGO. 9, el paso n.º 12 se determinó como el punto de inicio temprano de la senescencia de HMDEC.
Como se muestra enHIGO. 10, aproximadamente 10 5 HMDEC se transfectaron dos veces en días alternos con 0,75 mg de modRNA que codifican hTERT-CI y -WT en presencia del control Carrier Only (CO, RNiMAX). El recuento de células se realizó en los pases n.º 19, 20 y 21 cada vez el día 5 después de volver a sembrar.
Para el experimento que se muestra enHIGO. 11, en el intervalo entre el paso n.º 10 y el n.º 11 (y, como se indicó anteriormente, el paso n.º 12 corresponde al inicio temprano de la senescencia de HMDEC), se cultivaron aproximadamente 5 × 10 5 HMDEC por matraz de 75 cm 3 en medio EBM-2 soportado con suplemento EGM-2 MV (ambos de Lonza, Walkersville, Maryland, EE. UU., números de catálogo CC-3156 y CC-4176, respectivamente). Las células microvasculares se transfectaron tres veces en días alternos con 5 μg de modRNA que codifican hTERT-WT (WT) y hTERT-CI (CI) en presencia de matraces de control no tratados (UT) y solo portadores (CO, RNAiMAX). En cada punto de tiempo, se colocaron en placas 5 x 10 5 células y, a partir del pase n.° 11, se realizó un recuento de células a través de un hemocitómetro 5 días después de volver a colocar en placas. Para cada punto de tiempo, cada condición experimental se realizó por triplicado.
Para los experimentos mostrados enHIGO. 12, aproximadamente 10 5 de cada NT, hTERT-CI y hTERT-WT HMDEC del pase n.º 14 se trataron como se describe enHIGO. 10. A continuación, las células se sometieron a análisis de células senescentes basado en una tinción histoquímica para la actividad de β-galactosidasa a pH 6 utilizando un kit de tinción histoquímica de células de senescencia (Sigma, nº de catálogo CS0030). El lado izquierdo de la diapositiva muestra imágenes representativas de células no tratadas (NT) y células tratadas con hTERT-CI (CI) o hTERT-WT (WT) modRNA. Todas las imágenes se obtuvieron en condiciones idénticas de adquisición de imágenes. Cada condición experimental se realizó por triplicado y el porcentaje de células positivas para la actividad de β-galactosidasa (como se representa en el gráfico) para cada condición se calculó como un promedio de células positivas en tres áreas capturadas al azar.
Ejemplo 3. Caracterización adicional de los efectos del tratamiento con ARNmod de TERT en células humanasEn este ejemplo, el ARNm se transfectó a través de un lípido catiónico en fibroblastos y mioblastos humanos primarios (HIGO. 13A), células que se sabe que tienen una capacidad proliferativa limitada. Webster y Blau (1990) Somat Cell Mol Genet. 16:557-565; Hayflick y Moorhead (1961) Exp Cell Res. 25:585-621; Yakubov et al. (2010) Biochem Biophys Res Comun. 394:189-193. La eficiencia de la transfección se determinó utilizando la cuantificación de fluorescencia de células individuales por citometría de flujo después de la administración de ARNm de GFP, lo que mostró que la mayoría de las células (>90 %) se transfectaron incluso a concentraciones relativamente bajas de ARNm modificado (0,1 μg/ml) (HIGO. 13ByFIGURAS. 16A-16C). El tratamiento de células con concentraciones iguales de ARNm de TERT exógeno o ARNm que codifica una forma catalíticamente inactiva (CI) de TERT resultó en la internalización de cantidades similares de ARNm.HIGO. 16D), medido por RT-qPCR 24 h después del primer tratamiento. CI TERT tiene una mutación de sustitución en una de las tríadas de aspartatos de coordinación de metales en el sitio catalítico del dominio de transcriptasa inversa de TERT. Como resultado, CI TERT no puede agregar nucleótidos a los telómeros, pero permanece estructuralmente intacto, capaz de unirse al ADN molde y exhibe una estabilidad comparable a la TERT de tipo salvaje en lisados de reticulocitos. Wyatt (2009) Análisis Estructura - Función de la Transcriptasa Inversa de la Telomerasa Humana . Ni el tratamiento con ARNm de TERT ni con CI afectó los niveles de ARNm de TERT endógeno en relación con las células no tratadas según lo medido por RT-qPCR (HIGO. 16E). La transfección con 1 μg/ml de ARNm de TERT o CI TERT dio como resultado aumentos equivalentes al 50 % (P<0,05 y <0,01, respectivamente) en la cantidad de proteína TERT en fibroblastos (HIGO. 13C, panel izquierdo). Mecha et al. (1999) Gen. 232:97-106; Ahmed et al. (2008) J Cell Sci. 121:1046-1053. La presencia de proteína TERT endógena en células con poca actividad de telomerasa endógena es consistente con la abundancia relativa de variantes de corte y empalme inactivas de TERT en muchos tipos de células y la extensa regulación inhibitoria postraduccional de la actividad de TERT, como informaron previamente otros. Yi et al. (2001) Res. de ácidos nucleicos. 29:4818-4825; Cifuentes-Rojas y Shippen (2011) Mutat Res . [publicado en línea antes de la impresión: 18 de octubre de 2011]; doi:10.1016/j.mrfmmm.2011.10.003. El tratamiento con cantidades crecientes de ARNm de TERT dio como resultado un aumento dependiente de la dosis de la expresión de la proteína TERT medida en ensayos de células individuales por citometría de flujo (HIGO. 13C, panel derecho).
La actividad de la telomerasa aumenta transitoriamente.
Para probar si la entrega modificada de ARNm de TERT dio como resultado la generación de proteína TERT funcional, se cuantificó la actividad de la telomerasa mediante un ensayo TRAP basado en gel. Se detectó actividad de telomerasa en fibroblastos y mioblastos en todas las dosis de ARNm de TERT probadas (0,25, 0,5, 1,0 y 2,0 μg/ml), y no se detectó en células no tratadas o en células tratadas con vehículo solo o ARNm modificado que codifica CI TERT, incluso a la dosis más alta de 2,0 μg/ml (HIGO. 13D). Aunque TERT requiere que TERC forme un complejo de telomerasa funcional, la administración de TERT por sí sola fue suficiente para aumentar la actividad de la telomerasa, en consonancia con los hallazgos anteriores de que TERT a menudo es limitante ya que el número de copias de ARN de TERC es alto en muchos tipos de células que carecen de actividad de telomerasa, incluidos los fibroblastos. Yi et al. (2001) Res. de ácidos nucleicos.29:4818-4825. Un curso de tiempo reveló que la actividad de la telomerasa alcanzó su punto máximo a las 24 horas y volvió a los niveles iniciales dentro de las 48 horas posteriores a una única transfección. Este marco de tiempo es consistente con las vidas medias informadas anteriormente del ARNm de TERT humano (2-4 h), ARNm de β-globina humana (17-18 h: nuestro ARNm de TERT exógeno está flanqueado por β-globina 5 'y 3' UTR) y la actividad de la telomerasa en células expuestas a un inhibidor de la síntesis de proteínas (dependiente del tipo de célula, pero típicamente >24 h). Kabnick y Housman (1988) Mol Cell Biol. 8:3244-3250; Holt et al. (1997) Proc Natl Acad Sci USA. 94:10687-10692; Xu et al. (1999) Br J Cáncer. 80:1156-1161.
Alargamiento de Telómeros.
La longitud de los telómeros en fibroblastos no tratados disminuyó con el tiempo (3 meses) como se esperaba (62) (HIGO. 14A) y se cuantificó mediante dos métodos diferentes. Se utilizó el método de qPCR multiplex monocromo (MMqPCR) para evaluar la longitud, y las mediciones se validaron de forma independiente con un método de qPCR realizado por SpectraCell Laboratories, Inc. (coeficiente de correlación 0,97, P<0,001). Entrega de ARNm de TERT tres veces seguidas a intervalos de 48 horas a fibroblastos o mioblastos a partir de la duplicación de la población (PD) 25 y 6, respectivamente, telómeros extendidos en 0,9±0,1 kb (22±3%) y 0,7±0,1 kb ( 12±2%), respectivamente (FIGURAS. 14B, 14C). El tratamiento solo con vehículo o CI TERT mRNA no tuvo un efecto significativo sobre la longitud de los telómeros en relación con las células no tratadas. La tasa promedio de extensión de los telómeros en los fibroblastos fue de 135±15 pb/PD.
Aumentos dependientes del tipo celular en la capacidad proliferativa.
Para probar el efecto del suministro de ARNm de TERT modificado y la consiguiente extensión de los telómeros sobre la capacidad de proliferación celular, se transfectaron fibroblastos humanos una, dos o tres veces seguidas. Los tratamientos se administraron a intervalos de 48 horas. Los fibroblastos no tratados, tratados solo con vehículo y tratados con CI TERT mRNA exhibieron una meseta equivalente en el número de células después de aproximadamente 50-60 PD, mientras que las células tratadas tres veces con TERT mRNA continuaron proliferando durante un finito adicional de 28 ± 1.5 PD con un total aumento en el número de células de 2,7 × 10 8 más allá de las células no tratadas (HIGO. 14D, panel izquierdo). El efecto fue dependiente de la dosis y cada tratamiento adicional confirió DP adicional (HIGO. 14D, panel derecho). El incremento incremental en la capacidad proliferativa fue mayor con el primer tratamiento que con el segundo o tercer tratamiento. Los mioblastos humanos tratados tres veces seguidas cada 48 horas ganaron 3,4 ± 0,4 PD, lo que equivale a un aumento de 10 veces en el número de células en comparación con los controles no tratados o tratados con vehículo (HIGO. 14E). Tales diferencias en la PD entre mioblastos y fibroblastos no son inesperadas, ya que estudios previos encontraron efectos limitados similares de la sobreexpresión de TERT a unos pocos PD y demostraron que esta limitación se debió a una detención del crecimiento mediada por p16 en los mioblastos humanos, en contraste con los fibroblastos. Bodnar et al. (1998) Ciencia. 279:349-352; Zhu et al. (2007) Envejecimiento Celular.6:515-523. Tanto en los fibroblastos como en los mioblastos, el ARNm de CI TERT con vehículo solo no tuvo ningún efecto sobre la capacidad proliferativa en comparación con los controles no tratados. Estos datos muestran que la entrega de ARNm de TERT modificado es un método eficaz para aumentar la DP en cultivo. Es importante destacar que todas las células tratadas estudiadas exhibieron un aumento significativo en el número de células, pero finalmente alcanzaron una meseta en sus curvas de crecimiento, lo que demuestra la ausencia de inmortalización.
Reducción transitoria de marcadores de senescencia.
A medida que las poblaciones de fibroblastos dejaron de crecer, exhibieron marcadores de senescencia, incluida la tinción de β-galactosidasa (β-gal) asociada a la senescencia y tamaño agrandado.FIGURAS. 15A-15C). Cristofalo y Kritchevsky (1969) Med Exp Int J Exp Med. 19:313-320; Dimri et al. (1995) Proc Natl Acad Sci USA. 92:9363-9367; Cristófalo et al. (2004) Desarrollo de envejecimiento mecánico. 125:827-848; sin ley et al. (2010) Exp Gerontol. 45:772-778. Estos cambios se redujeron transitoriamente en los fibroblastos tratados con ARNm de TERT en relación con las células no tratadas y las células que recibieron ARNm de CI TERT o vehículo solamente. De acuerdo con los hallazgos de otros, no todas las células en las poblaciones que habían entrado en una meseta de crecimiento expresaron β-galactosidasa a niveles detectables. sin ley et al. (2010) Exp Gerontol. 45:772-778; Binet et al. (2009) Cáncer Res.69:9183-9191. Sin embargo, los fibroblastos y mioblastos transfectados con ARNm de TERT expresaron β-galactosidasa en el mismo grado que las células de control de cada tipo después de que las dos poblaciones alcanzaron una meseta de crecimiento. Estos datos demuestran que las células tratadas con ARNm de TERT eventualmente y de manera predecible cesan la división y expresan marcadores de senescencia y, por lo tanto, es poco probable que se transformen.
Este ejemplo demuestra que el suministro transitorio de ARNm de TERT que comprende nucleótidos modificados extiende los telómeros humanos y aumenta la capacidad de proliferación celular sin inmortalizar las células. La tasa de extensión de los telómeros en los fibroblastos observada aquí de 135±15 pb/PD es comparable a las tasas informadas usando métodos virales, de 94 a >150 pb/PD (22, 69). El ARNm de TERT modificado extendió los telómeros en fibroblastos en unos pocos días en 0,9 ± 0,1 kb. Se ha informado que las longitudes de los telómeros de fibroblastos se acortan durante la vida humana en aproximadamente 1-2 kb en promedio. Allsopp et al. (1992) Proc Natl Acad Sci USA. 89:10114-10118. Por lo tanto, el ARNm de TERT modificado es eficaz, pero transitorio y no integrante, superando las principales limitaciones de la entrega de ARNm de TERT viral expresado constitutivamente.
Las células humanas de mayor interés a menudo tienen un número limitado, incluidas las células madre para uso en experimentación o medicina regenerativa. Actualmente, este problema se está abordando mediante varios métodos, incluida la transferencia nuclear somática, los métodos virales para el suministro de genes y el uso de condiciones de cultivo que disminuyen la tasa de acortamiento de los telómeros. Le et al. (2013) Célula Madre Célula . [publicado en línea antes de la impresión: 19 de noviembre de 2013]; doi:10.1016/j.stem.2013.11.005; Zimmermann y Martens (2008) Res. de tejido celular. 331:79-90; Mohsin et al. (2013) Circo Res.113:1169-1179. El tratamiento de ARNm de TERT modificado descrito aquí proporciona un complemento ventajoso o una alternativa a estos métodos que es breve, extiende los telómeros rápidamente y no corre el riesgo de mutagénesis por inserción. La brevedad del tratamiento con ARNm de TERT es particularmente atractiva porque puede evitar la pérdida del fenotipo de células madre que puede ocurrir con el tiempo en el cultivo (Gilbert et al. (2010) Science. 329:1078-1081) y acortar la etapa posterior a la reprogramación. de generación de iPSC durante la cual se extienden los telómeros (Wang et al. (2012) Cell Res. 22:757-768). Tal método de extensión de telómeros tiene el potencial de aumentar la utilidad de diversos tipos de células para el modelado de enfermedades, la detección de fármacos mejoradores y el uso en terapias celulares.
Se observó un espectro de efectos sobre la capacidad proliferativa para los tipos de células probados, de acuerdo con estudios previos que demostraron diferentes efectos de la sobreexpresión de TERT sobre la capacidad proliferativa de mioblastos y fibroblastos. Bodnar et al. (1998) Ciencia. 279:349-352; Zhu et al. (2007) Envejecimiento Celular.6:515-523. Además, la cantidad de extensión de los telómeros no se correlacionó con la capacidad proliferativa. Por lo tanto, el contexto celular determina la eficacia de la expresión de TERT en la capacidad proliferativa y la comprensión de los factores que median este efecto es de interés para superar esta limitación. Los factores que se han implicado en la limitación de la capacidad proliferativa de mioblastos tras la sobreexpresión de TERT viral incluyen la detención del crecimiento mediada por p16, el tipo de célula y la cepa, y las condiciones de cultivo. Zhu et al. (2007) Envejecimiento Celular. 6:515-523. De manera más general, el efecto puede estar mediado por el daño del ADN no telomérico, la edad y la integridad mitocondrial. Sahin et al. (2011) Naturaleza. 470:359-365; Mourkioti et al. (2013) Nat Cell Biol. 15:895-904; López-Otín et al. (2013) Célula.153:1194-1217. La ausencia de un aumento en la longitud de los telómeros o la capacidad de proliferación celular en las células transfectadas con ARNm de CI TERT es consistente con el tratamiento que actúa a través del sitio catalítico de TERT mediante el cual los nucleótidos se agregan directamente a los telómeros. Las poblaciones de células tratadas con ARNm de TERT aumentaron en número exponencialmente durante un período de tiempo y luego finalmente dejaron de expandirse y exhibieron marcadores de senescencia en un grado similar al de las poblaciones no tratadas, en consonancia con la ausencia de inmortalización.
La naturaleza transitoria de no integración del ARNm modificado y el aumento finito de la capacidad proliferativa observado aquí lo hacen más seguro que los vectores virales o de ADN utilizados actualmente. Además, el método extiende los telómeros rápidamente para que el tratamiento sea breve, después de lo cual el mecanismo protector de acortamiento de los telómeros permanece intacto. Este método se puede usar ex vivo para tratar tipos de células que median ciertas condiciones y enfermedades, como células madre hematopoyéticas o progenitores en casos de inmunosenescencia o insuficiencia de la médula ósea. Además, el ARNm modificado puede administrarse a ciertos tejidos in vivo. Kormann et al. (2011) Nat Biotechnol.29:154-157. En resumen, el método rápido y seguro para la extensión rápida de los telómeros descrito aquí conduce a la senescencia retrasada y al aumento de la capacidad de proliferación celular sin inmortalizar las células humanas.
Métodos
Síntesis y generación de plantillas de ARNm.
Para generar ARNm modificado que codifica GFP, TERT y CI TERT, se insertaron sus respectivos marcos abiertos de lectura (ORF) en el MCS de un plásmido inicial que contenía el promotor T7, el 5′UTR de la globina b humana (HBB), el MCS , la UTR 3' de HBB, una secuencia poli-A de 151 pb y un sitio de restricción para la linealización con una enzima de clase II que sigue a la secuencia poli-A. Los plásmidos intermedios resultantes se secuenciaron, linealizaron y transcribieron utilizando el tampón y la ARN polimerasa del kit MEGAscript T7 (Ambion, Austin, Tex., EE. UU.) y una mezcla personalizada de nucleótidos canónicos y no canónicos (TriLink BioTechnologies, San Diego , California, EE. UU.) en el que las concentraciones finales de nucleótidos por 40 μl de reacción IVT fueron de 7,5 mM para cada uno de adenosina-5′-trifosfato (ATP), 5-metilcitidina-5′-trifosfato (m5C) y pseudouridina-5′ -trifosfato (Ψ), 1. 5 mM para guanosina-5′-trifosfato (GTP) y 6 mM para el análogo cap (ARCA) (New England Biolabs, Ipswitch, Mass., EE. UU.), o una relación molar de ATP:m5C:T:GTP:ARCA de 1:1:1:0.2:0.8. Para disminuir aún más la inmunogenicidad potencial del ARNm relacionado con la fracción portadora de 5′-3P, los productos IVT se trataron con fosfatasa antártica (New England Biolabs). El tamaño y la integridad de los productos de ARNm se verificaron mediante electroforesis en gel de agarosa desnaturalizante. El ORF de TERT humano de tipo salvaje utilizado para generar las plantillas de ADN para la síntesis de ARNm es idéntico a la variante 1 del transcrito de TERT humano del NCBI (secuencia de referencia NM_198253.2). El ORF se generó a partir del plásmido pBABE-neo-hTERT (Counter et al. (1998) ARCA de 1:1:1:0.2:0.8. Para disminuir aún más la inmunogenicidad potencial del ARNm relacionado con la fracción portadora de 5′-3P, los productos IVT se trataron con fosfatasa antártica (New England Biolabs). El tamaño y la integridad de los productos de ARNm se verificaron mediante electroforesis en gel de agarosa desnaturalizante. El ORF de TERT humano de tipo salvaje utilizado para generar las plantillas de ADN para la síntesis de ARNm es idéntico a la variante 1 del transcrito de TERT humano del NCBI (secuencia de referencia NM_198253.2). El ORF se generó a partir del plásmido pBABE-neo-hTERT (Counter et al. (1998) ARCA de 1:1:1:0.2:0.8. Para disminuir aún más la inmunogenicidad potencial del ARNm relacionado con la fracción portadora de 5′-3P, los productos IVT se trataron con fosfatasa antártica (New England Biolabs). El tamaño y la integridad de los productos de ARNm se verificaron mediante electroforesis en gel de agarosa desnaturalizante. El ORF de TERT humano de tipo salvaje utilizado para generar las plantillas de ADN para la síntesis de ARNm es idéntico a la variante 1 del transcrito de TERT humano del NCBI (secuencia de referencia NM_198253.2). El ORF se generó a partir del plásmido pBABE-neo-hTERT (Counter et al. (1998) El ORF de TERT humano de tipo salvaje utilizado para generar las plantillas de ADN para la síntesis de ARNm es idéntico a la variante 1 del transcrito de TERT humano del NCBI (secuencia de referencia NM_198253.2). El ORF se generó a partir del plásmido pBABE-neo-hTERT (Counter et al. (1998) El ORF de TERT humano de tipo salvaje utilizado para generar las plantillas de ADN para la síntesis de ARNm es idéntico a la variante 1 del transcrito de TERT humano del NCBI (secuencia de referencia NM_198253.2). El ORF se generó a partir del plásmido pBABE-neo-hTERT (Counter et al. (1998)Proc Natl Acad Sci USA. 95:14723-14728) (plásmido 1774, Addgene, Cambridge, Mass., EE. UU.). El plásmido pBABE-neo-hTERT tenía una mutación no silenciosa en el residuo 516 en el motivo QFP de TERT, un motivo asociado con la multimerización y la interacción de TERT con el ARN de TERC y, por lo tanto, para evitar la posibilidad de artefactos debido a esta mutación, hicimos el secuencia idéntica a la secuencia de referencia NCBI corrigiendo la mutación con el cambio G516D. El mutante CI TERT se generó a partir de la secuencia TERT introduciendo la mutación D712A.
Cultivo y Tratamiento Celular.
Se obtuvieron fibroblastos MRC5 de pulmón fetal primario humano de ATCC (Manassas, Virginia, EE. UU.) en el paso 14. ATCC no indica el número de PD, por lo tanto, nuestros valores de PD citados en este documento se refieren al número de PD después de recibir células de ATCC. Las células MRC5 se cultivaron en DMEM con FBS al 20 % y penicilina-estreptomicina. Se cultivaron mioblastos primarios de músculo esquelético humano de 30 años (Lonza, Allendale, NJ, EE. UU.) en medio SkGM-2 (Lonza) de acuerdo con las instrucciones del proveedor. Las duplicaciones de la población se calcularon como el logaritmo en base 2 de la relación entre las células recolectadas y las células sembradas en placas en el paso anterior, y se consideró cero si se recolectaron menos células que las sembradas. Las células se transfectaron con ARNm de TERT modificado utilizando Lipofectamine RNAiMax (Life Technologies, Grand Island, NY, EE.
Medición de la actividad de la telomerasa.
Veinticuatro horas después del comienzo del período de transfección, las células se recolectaron y lisaron en tampón CHAPS. El ensayo TRAP se realizó utilizando una versión modificada del kit TRAPeze (EMD Millipore, Billerica, Mass., EE. UU.), en el que los cebadores y la polimerasa se añadieron después, en lugar de antes, del paso durante el cual se extiende el sustrato de telómero artificial. El programa de PCR fue de 94 °C, 30 s/59 °C, 30 s/72 °C, 45 s durante 30 ciclos, y los productos se corrieron en un gel de poliacrilamida al 15 % en 0,5 × TBE teñido con SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain (Life Technologies, Grand Island, Nueva York, EE. UU.). El curso temporal de la actividad de la telomerasa se realizó utilizando el kit TRAPeze RT (EMD Millipore, Billerica, MA, EE. UU.).
Mancha occidental.
La proteína se recogió lavando las células una vez con PBS y luego lisando las células en tampón RIPA (Cell Signaling Technology, Danvers Mass., EE. UU.). La proteína se corrió en NuPAGE Novex Tris-Acetate Gels (Life Technologies, Grand Island, NY, EE. UU.), se transfirió a una membrana de PVDF durante 2 h a 35 V, luego se hibridó con tubulina anti-α (Sigma, St. Louis, MO, EE. UU. ) a 1:10 000 y anticuerpo anti-TERT (ABCAM, Cambridge, Mass., EE. UU., 32020 a 1:1000; o Rockland Immunochemicals, Gilbertsville, Pa., EE. UU., 600-401-252S a 1:500) e incubado durante la noche a 4°C. La detección se realizó usando anticuerpos infrarrojos (680 nm y 800 nm) (LI-COR, Lincoln, Nebr., EE. UU.) y el generador de imágenes Odyssey (LI-COR). La intensidad total de cada banda se cuantificó utilizando ImageJ (NIH, Bethesda, Maryland, EE. UU.). La intensidad de cada banda de TERT fue normalizada por su correspondiente banda de tubulina.
Citometría de flujo.
Las células se recolectaron 24 h después de la transfección con las dosis indicadas (FIGURAS. 16A-16C) de ARNm de TERT y teñido con anticuerpo anti-TERT (Rockland Immunochemicals, Gilbertsville, Pa., EE. UU.; 600-401-252S) a 1:500.
Medición de la longitud de los telómeros por SpectraCell Laboratories, Inc.
El ADN genómico se extrajo con fenol cloroformo y se cuantificó con el kit de ensayo Quant-iT™ PicoGreen® dsDNA (Life Technologies, Grand Island, NY, EE. UU.). El análisis de la longitud de los telómeros se realizó en SpectraCell Laboratories Inc. (Houston, Tex., EE. UU.) utilizando un ensayo qPCR de alto rendimiento aprobado por CLIA, esencialmente como lo describen Cawthon et al. Cawthon (2002) Res. de ácidos nucleicos. 30(10):e47; Cawthon (2009) Res. de ácidos nucleicos.37(3):e21. El ensayo determina la longitud relativa de los telómeros midiendo el factor por el cual la muestra difiere de una muestra de ADN de referencia en su relación entre el número de copias repetidas de los telómeros y el número de copias del gen único (36B4). Se cree que esta relación (relación T/S) es proporcional a la longitud promedio de los telómeros. Todas las muestras se analizaron al menos por duplicado con al menos un control negativo y dos controles positivos de dos longitudes de telómero conocidas diferentes (alta y baja) y se observó una variación promedio de hasta el 8 %. Los resultados se informaron como una puntuación de telómeros equivalente a la longitud promedio de los telómeros en kb.
Medición de la longitud de los telómeros por MMqPCR.
La longitud de los telómeros se midió utilizando una versión modificada del protocolo MMqPCR desarrollado por Cawthon (Cawthon (2009) Nucleic Acids Res.37(3):e21) con los siguientes cambios: Se agregaron ciclos adicionales de preamplificación de PCR para hacer que el producto del telómero se amplifique antes, ampliando la brecha entre el telómero y las señales génicas de una sola copia; se determinó experimentalmente que una mezcla de dos polimerasas Taq resultó en mejores eficiencias de reacción de PCR que cada una por sí sola; la reducción de la concentración de SYBR Green de 0,75× a 0,5× dio como resultado una señal más temprana. El ADN genómico se recolectó de las células usando el kit PureGene (Qiagen Germantown, Maryland, EE. UU.) con digestión con RNasa, se cuantificó usando un NanoDrop 2000 (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU.) y se usaron 10-40 ng por 15 μl. Reacción de qPCR realizada por cuadruplicado utilizando un sistema de PCR LightCycler 480 (Roche, Basilea, Suiza). Una dilución en serie de ADN de referencia que abarca cinco puntos desde 100 ng/μl hasta 1. Se incluyeron 23 ng/μl en cada ensayo para generar una curva estándar necesaria para la cuantificación del ADN de la muestra. Las concentraciones finales de reactivos en cada reacción de PCR de 15 μl fueron: Tris-HCl 20 mM pH 8,4, KCl 50 mM, MgCl2 3 mM, dNTP 0,2 mM cada uno, DTT 1 mM, betaína 1 M (Affymetrix, Santa Clara, California, EE. EE. UU.), 0,5 × SYBR Green I (Life Technologies, Grand Island, NY, EE. UU.), 0,1875U Platinum Taq (Life Technologies, Grand Island, NY, EE. UU.), 0,0625 × Titanium Taq (Clontech) y 900 nM de cada cebador ( Secuencias de cebadores telg, telc, hbgu y hbgd especificadas en Cawthon (2009)Ácidos Nucleicos Res.37(3):e21. El programa de ciclos térmicos fue: 2 minutos a 95°C; seguido de 6 ciclos de 15s a 95°C, 15s a 49°C; seguido de 40 ciclos de 15s a 95°C, 10s a 62°C, 15s a 72°C con adquisición de señal, 15s a 84°C y 10s a 88°C con adquisición de señal. Se utilizó el software Roche LightCycler 480 para generar curvas estándar y calcular las concentraciones de ADN de telómero y genes de copia única para cada muestra. Se calcularon las proporciones T/S para cada réplica de la muestra y se promedió el resultado para obtener la proporción T/S de la muestra que se calibró usando muestras duplicadas ciegas de células de referencia enviadas a SpectraCell como se describe anteriormente. Los valores relativos obtenidos de forma independiente de las relaciones T/S medidos mediante MMqPCR y por SpectraCell para las mismas muestras fueron muy consistentes (coeficiente de correlación = 0,97, P <0,001).
qPCR de transcripción inversa.
Los cebadores se diseñaron utilizando Primer3 (Untergasser et al. (2012) Nucleic Acids Res.40:e115) y se enumeran en la Tabla 9 excepto donde se indique lo contrario. Veinticuatro horas después del inicio del tratamiento, las células se lavaron tres veces con PBS antes de recolectarlas en Buffer RLT (Qiagen, Germantown, Maryland, EE. UU.). El ARN se convirtió en ADNc utilizando una mezcla maestra de ARN a ADNc de alta capacidad (Life Technologies, Grand Island, NY, EE. UU.). El ARNm de TERT endógeno se amplificó utilizando un cebador directo en el marco de lectura abierto de TERT y un cebador inverso en la UTR 3 'del ARNm de TERT endógeno. El ARNm de TERT exógeno se amplificó utilizando un cebador directo en el marco de lectura abierto del ARNm de TERT y un cebador inverso en la UTR 3 'de HBB presente en nuestro ARNm de TERT exógeno y CI TERT, pero no en el ARNm de TERT endógeno. Los niveles relativos se calcularon utilizando el método de Pfaffl. Los genes de referencia fueron RPL37A (usando cebadores especificados en Greber et al. (2011)EMBO J. 30:4874-4884) y GAPDH, ninguno de los cuales mostró un cambio significativo en el valor de Ct en las células de control o tratadas.
| TABLA 9 |
|
| Secuencias de cebadores. |
| Hacia adelante | Marcha atrás | Producto |
| cebador | cebador | longitud |
| Objetivo | (5′-3′) | (5′-3′) | (pb) |
|
| Exo- | hTERT | 3′UTR de HBB | 162 |
| generoso | (NM_198253.2) | AGCAAGAAAGCGA | |
| TERCERO | GTCACCTACGTGC | GCCAAT | |
| CACTCCT | (SEQ ID NÚM: 6) | |
| (SEQ ID NÚM: 5) | | |
|
| Endo- | hTERT | 3′UTR de hTERT | 74 |
| generoso | (NM_198253.2) | (NM_198253.2) | |
| TERCERO | GCCCTCAGACTTC | GCTGCTGGTGTCTGC | |
| AAGACCA | TCTC | |
| (SEQ ID NÚM: 7) | (SEQ ID NO: 8) | |
|
| GAPDH | CAATGACCCCTTCA | TTGATTTTGGAGGG | 159 |
| TTGACC | ATCTCG | |
| (SEQ ID NÚM: 9) | (SEQ ID NO: 10) |
|
Tinción de β-galactosidasa asociada a la senescencia y puntuación del tamaño celular.
La tinción de β-gal se realizó utilizando el kit de tinción Senescence β-galactosidasa (Cell Signaling Technology, Danvers Mass., EE. UU.). Se puntuaron por duplicado al menos 50 células por población. El diámetro celular se puntuó manualmente después de la tripsinización en una rejilla de hemocitómetro. Cristofalo y Kritchev sky (1969) Med Exp Int J Exp Med. 19:313-320.
Estadísticas.
Los cálculos de las pruebas T de Student y del coeficiente de correlación de Pearson se realizaron utilizando Microsoft Excel. Las barras de error representan la media ± sem
Ejemplo 4. Entrega de modRNA TERT a células por electroporaciónLos compuestos de ARNmod de TERT de la invención también se pueden administrar a las células mediante electroporación, como se ilustra enFIGURAS. 18-20, utilizando parámetros de electroporación, incluida la concentración de modRNA de TERT, la forma de onda de voltaje y la geometría de electrodo adecuada para lograr una eficiencia y viabilidad de transfección óptimas en un tipo de célula determinado.HIGO. 21muestra la dependencia de la actividad de la telomerasa de la dosis de modRNA de TERT administrada por electroporación.
Ejemplo 5. Entrega de un modRNA a células sanguíneas humanasLas células T CD8+ se transfectaron con modRNA de la siguiente manera. La capa leucocitaria de sangre humana completa se centrifugó en medio de gradiente de densidad Lymphoprep (Axis-Shield) para obtener células mononucleares que se lavaron dos veces y luego se eliminaron los leucocitos no CD8+ utilizando el kit de células T CD8 humanas sin tocar de Dynabeads (Life Technologies). Las células CD8+ se estimularon utilizando Dynabeads Human T-Activator CD3.CD28 (Life Technologies) y se cultivaron durante 4 días utilizando medios OpTimizer T-Cell suplementados con 30.000 U/ml de IL-2. Luego, las células T se transfectaron con modRNA que codifica GFP nuclear y TERT a una concentración de 50 μg/ml en un volumen de 20 μl de solución de Nucleofector P3 que contenía el Suplemento 1. Se analizó la fluorescencia y la viabilidad de las células 24 horas después de la transfección. Los resultados de la transfección se muestran enHIGO. 22. La fluorescencia brillante demuestra un alto número de copias, con una eficiencia de transfección superior al 90 % con alta viabilidad.
Ejemplo 6. Expresión de telomerasa en queratinocitos humanos utilizando un ARNmod de telomerasaComo se muestra enHIGO. 23, la electroporación de queratinocitos humanos con modRNA de TERT da como resultado la expresión de la actividad de la telomerasa en las células. Los queratinocitos primarios humanos (Lonza) se suspendieron a una densidad de 3 × 10 7células/ml en medio OptiMEM (Life Technologies) que contiene 50 μg/ml de modRNA que codifica TERT catalíticamente inactivo (CI) o TERT de tipo salvaje. Se colocaron 10 μl de la suspensión celular en una cubeta con un espacio de 1 mm y se sometieron a electroporación usando un Gene Pulser (BioRad) usando 200 V, 1000 ohmios y 25 microfaradios. Las células se devolvieron inmediatamente al medio KGM-2 (Lonza) y se incubaron durante 24 horas antes de recolectarlas para medir la actividad de la telomerasa utilizando el ensayo TRAPeze basado en gel (Millipore). Cada reacción de TRAP de 25 μl se realizó usando 1 μg de proteína total, con muestras duplicadas calentadas a 85 °C durante 10 minutos para inactivar la telomerasa. Las muestras no tratadas, de electroporación solamente y CI TERT sirvieron como controles negativos, y las células 293T y TSR8 sirvieron como controles positivos.
Ejemplo 6. Expresión de una proteína codificada por modRNA mediante administración in vivoEl modRNA entregado in vivo puede resultar en la expresión de una proteína funcional codificada por el modRNA. Kormann et al. (2012) Nature Biotechnology 29:154-157; Kariko et al. (2012) Terapia Molecular 20:948-93. Esto se ha confirmado aquí mediante la complejación de 2 μg de modRNA que codifica luciferasa con un vehículo de lípidos catiónicos (TransIT) e inyectando por vía intravenosa en 50 μl de OptiMEM (Life Technologies) en una cola de roedor. Se recogió el bazo y se trató con luciferina y se analizó la actividad de la luciferasa utilizando un generador de imágenes por bioluminiscencia IVIS (Perkin-Elmer). Como se muestra enHIGO. 24, se detectó actividad de luciferasa en el sitio de inyección y en el bazo (flechas).
Todas las patentes, publicaciones de patentes y otras referencias publicadas mencionadas en este documento se incorporan aquí por referencia en su totalidad como si cada una se hubiera incorporado individual y específicamente por referencia en este documento.
Si bien se han proporcionado ejemplos específicos, la descripción anterior es ilustrativa y no restrictiva. Cualquiera o más de las características de las realizaciones descritas anteriormente se pueden combinar de cualquier manera con una o más características de cualquier otra realización de la presente invención. Además, muchas variaciones de la invención resultarán evidentes para los expertos en la técnica tras la revisión de la memoria descriptiva. Por lo tanto, el alcance de la invención debe determinarse por referencia a las reivindicaciones adjuntas, junto con su alcance completo de equivalentes.
.jpg)
.jpg)
.jpg)
